代謝工程改造Escherichiacoli生產(chǎn)3-羥基丙酸

程秀麗，秦海彬，熊濤，牛坤*

1(浙江工業(yè)大學(xué), 浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工業(yè)大學(xué), 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州，310014)

研究報告

代謝工程改造Escherichiacoli生產(chǎn)3-羥基丙酸

程秀麗1, 2，秦海彬1, 2，熊濤1, 2，牛坤1, 2*

1(浙江工業(yè)大學(xué), 浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州，310014) 2(浙江工業(yè)大學(xué), 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州，310014)

以提高3-羥基丙酸的產(chǎn)量為目標(biāo)，對實驗室構(gòu)建的基因工程大腸桿菌進(jìn)行改造，敲除形成副產(chǎn)物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脫氫酶基因yqhD，得到E.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)，該工程菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到2.53 g/L，相比未敲除yqhD基因的菌株，產(chǎn)量提高了5.8倍。另外，敲除了甘油代謝途徑中的抑制因子glpR基因，得到E.coliW3110ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)，該工程菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到2.86 g/L，相比未敲除glpR基因的菌株，產(chǎn)量提高了6.7倍。后經(jīng)5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)后，3-羥基丙酸的產(chǎn)量提升到15.4 g/L。該實驗為進(jìn)一步利用大腸桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸提供了研究基礎(chǔ)。

3-羥基丙酸；甘油代謝；基因敲除；重組大腸桿菌

隨著石油資源的日漸減少及其導(dǎo)致的溫室效應(yīng)等環(huán)境問題日益嚴(yán)重，生物柴油應(yīng)運而生。然而，生物柴油產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物甘油，使得甘油的價格急劇下降[1]。許多研究者都致力于利用生物柴油產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)生的大量甘油來生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品。因此，利用甘油生物轉(zhuǎn)化為高附加值的生物化工產(chǎn)品已成為一個高度活躍的研究領(lǐng)域[2]。當(dāng)前利用甘油為底物生產(chǎn)的下游產(chǎn)物主要有：1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PDO)、環(huán)氧氯丙烷、乙二醇、乳酸、二羥基丙酮及3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)等[3]。

3-HP是一種重要的平臺化合物，是一種無色無味的油狀液體，可與水、醇、醚等多種有機(jī)溶劑互溶。由于其具有羧基和羥基兩種官能團(tuán)，因而在化學(xué)反應(yīng)中是多種化工原料的合成前體物質(zhì)[4]，如脫水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，與醇脂化作用生成酯，還可以通過還原作用生成1,3- PDO等[5-6]。同時3-HP還可以用來生產(chǎn)可降解環(huán)保塑料及醫(yī)用生物材料等[7]?；?-HP在商業(yè)上的巨大開發(fā)價值，2004年8月美國能源部將3-HP列為當(dāng)今世界上12種最具開發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一[8]。

3-HP的生物合成方法按照底物的不同，主要分為兩種類型：分別以葡萄糖和甘油為底物[9-11]。由于甘油目前產(chǎn)能過剩，且合成3-HP的路徑比較簡單，近年來得到了廣泛而深入的研究。采用大腸桿菌產(chǎn)3-HP 的代謝途徑如圖1所示[12]。

縮寫：G-3-P， 甘油三磷酸；DHAP， 二羥丙酮磷酸；PEP， 磷酸烯醇丙酮酸圖1 大腸桿菌利用甘油的部分代謝途徑Fig．1 The partial pathways involved in the respiratory utilization of glycerol in E. coli

目前文獻(xiàn)中對大腸桿菌重組發(fā)酵合成3-HP的研究主要集中在新型高活力的醛脫氫酶的篩選、甘油代謝途經(jīng)改造和NAD+輔酶再生等方面[12-14]。CHU等[13]篩選到來源于鉤蟲貪銅菌 (Cupriavidusnecator) 的新型醛脫氫酶GabD4，同時敲除了E.coliW3110(DE3)基因組中合成乙酸的關(guān)鍵基因ackA-pta以及催化3-羥基丙醛 (3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)合成1,3-PDO的關(guān)鍵基因yqhD后，利用葡萄糖和甘油進(jìn)行雙底物發(fā)酵，3-HP的產(chǎn)量提高到71.9 g/L。

KIM等[14]篩選到來源于銅綠假單胞菌 (PseudomonasaeruginosaPSPA7_3072) 的半醛脫氫酶PSALDH，將其與短乳桿菌 (Lactobacillusbrevis) 的甘油脫水酶DhaB-DhaR共表達(dá)于E.coliBL21 (DE3)中構(gòu)建重組菌株，又敲除了甘油競爭途徑中合成3-磷酸甘油的glpK基因、甘油脫氫酶glpA基因和催化3-HPA合成1,3-PDO的yqhD基因，使3-HP產(chǎn)量達(dá)到57.3 g/L。

本研究以實驗室構(gòu)建的產(chǎn)3-HP的工程菌E.coliW3110 (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)為出發(fā)菌株，擬通過控制甘油代謝途徑，減少甘油抑制因子的抑制作用[12,15-16]，并阻斷代謝過程中副產(chǎn)物1,3-PDO的形成途徑，使3-HPA在醛脫氫酶的作用下更多的轉(zhuǎn)化為3-HP。從而獲得具有工業(yè)應(yīng)用價值、性能優(yōu)良的工程菌，進(jìn)一步提高3-HP 的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實驗所用質(zhì)粒與菌株見表1。

表1 本研究中所用的菌株和質(zhì)粒

1.1.2 試劑

Phamta super-Fidelity DNA polymerase購自諾維贊公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、XhoI、NcoI、NdeI 、TaqDNA聚合酶及T4DNA連接酶、IPTG均購自Thermo生物公司；卡那霉素、氯霉素、鏈霉素和氨芐青霉素購自北京Solarbio公司；DNA Marker、protein Marker和染色劑Gold View購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒及凝膠回收試劑購自杭州Axygen生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；進(jìn)口蛋白胨、進(jìn)口酵母粉購自北京Oxoid公司；3-HP標(biāo)準(zhǔn)品購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，其他試劑均為市售分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)條件和菌株培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)pH值7.0左右，根據(jù)需要加入相應(yīng)抗生素。固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉20 g/L。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油 30 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，Na2HPO4·12H2O 22.7 g/L，KH2PO43 g/L，酵母膏4 g/L，(NH4)2SO43.2 g/L。121 ℃滅菌20 min，需添加氯霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L、VB120.02 g/L，pH 7.0左右。

試管培養(yǎng)條件：單菌落接種到試管中，30 ℃(37 ℃)，200 r/min，培養(yǎng)過夜；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件：種子液接種搖瓶，37 ℃(28 ℃)，150 r/min，培養(yǎng)35 h；5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)條件：種子液接種到發(fā)酵罐，37 ℃(28 ℃)，400 r/min，控制pH 7.0左右，培養(yǎng)45 h。

1.1.4 儀器和設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀，Biometra TProfessional standard 96 Gradient；全自動凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad Moleculat Imager Gel DOCTM XR+；電轉(zhuǎn)儀，BIO-RAD MicroPulser；臺式高速離心機(jī)，Eppendorf AG 22331 Hamburg；高速冷凍離心機(jī)，BECKMAN COULTER Avanti J-26S XP；酶標(biāo)儀，SpectraMax M5；高效液相色譜，Waters，Milford，USA。

1.2方法

1.2.1 線性打靶片段的獲得

glpR基因敲除菌構(gòu)建方法為：以E.coliK12-glpR::kan基因組DNA為模版，利用PCR擴(kuò)增出glpR::kan打靶片段并進(jìn)行純化。同樣，利用此方法得到y(tǒng)qhD的線性打靶片段。本實驗所用引物如表2所示。

表2 本實驗所用引物

1.2.2 電擊感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化方法

將輔助質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化入E.coliW3110，培養(yǎng)溫度30 ℃，添加50μg/mL氨芐青霉素。大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備參見《分子克隆實驗指南》[17]。

1.2.3 工程菌的轉(zhuǎn)化

產(chǎn)3-HP的大腸桿菌工程菌種的構(gòu)建是利用同源重組的方法進(jìn)行基因敲除來實現(xiàn)的[18-19]，以敲除菌株E.coliW3110ΔglpR構(gòu)建為例，首先將glpR::kan打靶片段經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化(電擊條件：2.5 kV/cm，2 mm電擊杯)轉(zhuǎn)化到工程菌E.coliW3110-pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過電轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在1 mL LB液體培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)1 h，再把培養(yǎng)液涂布在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h。

1.2.4 陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

通過菌落PCR驗證篩選出同源重組的工程菌，即Kan抗性基因經(jīng)同源重組已整合到染色體上。將獲得的E.coliW3110Δgene::kan制備成化學(xué)感受態(tài)；再將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化到E.coliW3110Δgene::kan感受態(tài)中，涂布Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h。挑取單菌落在kan平板上劃線檢測kan抗性是否消除；利用pCP20含有的溫度敏感基因repA101(Ts)來消去該質(zhì)粒，挑取在Amp抗性平板上生長而不能在Kan抗性平板上生長的單菌落，接種到LB無抗試管中，37 ℃培養(yǎng)8 h，然后42 ℃ 10 h左右，涂布與LB無抗平板上劃線分離單菌落；挑取單菌落在Amp和Kan平板上劃線驗證，在兩種平板上均不生長的單菌落，利用菌落PCR驗證篩選出陽性工程菌E.coliW3110ΔyqhD和E.coliW3110ΔglpR。

1.2.5 高效液相色譜檢測3-HP及其他副產(chǎn)物的方法

將待檢測的發(fā)酵液經(jīng)轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心2 min，取上清液經(jīng)0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾后，利用高效液相色譜法分析3-HP和其他副產(chǎn)物的含量。檢測條件為：Waters 高效液相色譜儀，紫外檢測器與折光示差檢測器，色譜柱為Aminex HPX-87H柱，柱溫60 ℃，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。進(jìn)樣量20 μL，采用外標(biāo)法定量。

1.2.6 工程菌株生長及發(fā)酵產(chǎn)3-HP的研究

將質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpd1-Tukgsadh和pACYCDuet-tac-dhaB1-4共轉(zhuǎn)化至驗證正確的敲除菌E.coliW3110ΔglpR和E.coliW3110ΔyqhD中，通過菌落PCR驗證得到工程菌E.coliW3110ΔglpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet- tac-dhaB1-4) 和E.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)。將上述2株工程菌同未敲除菌一起接種培養(yǎng)，在搖瓶和5L發(fā)酵罐中分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，定時取樣測定OD值，并留存樣品進(jìn)行高效液相色譜的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1glpR基因敲除菌株的構(gòu)建與驗證

甘油抑制因子glpR屬于細(xì)菌調(diào)控蛋白DeoR超家族，它抑制了整個甘油代謝路徑，YANG等發(fā)現(xiàn)該基因調(diào)控著整個甘油代謝途徑，且與甘油磷酸脫氫酶glpD的基因序列相似[15-16]。JUNG等人比較了甘油代謝途徑中的glpR基因?qū)Ω视腿姿崦摎涿富騡lpT、厭氧甘油三磷酸脫氫酶基因glpA、好氧甘油三磷酸脫氫酶基因glpD、甘油異化蛋白因子glpF和甘油激酶基因glpK等基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示在敲除glpR基因后，上述酶的表達(dá)量都有明顯提升[12]。因此為了解除glpR對甘油代謝中的抑制作用，本實驗中考察了在宿主菌基因組中敲除glpR基因?qū)Ω视痛x和3-HP產(chǎn)量的影響。

2.1.1 篩選陽性克隆E.coliW3110ΔglpR

甘油抑制因子glpR基因的敲除是以E.coliK12-glpR::kan基因組DNA為模版，利用PCR擴(kuò)增出和glpR基因含有相同的上下同源臂的glpR::kan打靶片段并進(jìn)行純化；然后制備含有pKD46的E.coliW3110電轉(zhuǎn)感受態(tài)，再將純化后的打靶片段通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到E.coliW3110中，經(jīng)菌落PCR驗證，由圖2A所示，片段1-5大小與陽性對照一致，證明Kan抗性成功替代了E.coliW3110菌株染色體上的甘油抑制因子的基因位置；之后通過導(dǎo)入pCP20質(zhì)粒消除Kan抗性，經(jīng)菌落PCR后，結(jié)果如圖2B所示，陰性對照是以E.coliK12-glpR::kan基因組為模板擴(kuò)增的打靶片段長度1723 bp，理論上卡那抗性基因消除的菌株經(jīng)過敲除引物擴(kuò)增，僅有同源臂距離大小，約450 bp左右，結(jié)果顯示條帶2、3大小與理論相符合，因而可以確定該菌株中的卡那抗性消除，通過測序，最終確定該菌株為E.coliW3110ΔglpR。

A: M -2000bp marker; control -陽性對照 條帶1～5 -glpR::kan打靶片段的菌落PCR結(jié)果 B:M -5000bp marker; control -陰性對照; 條帶1～3-敲除glpR基因的菌落PCR結(jié)果圖2 E.coli W3110-glpR::kan和E.coli W3110ΔglpR菌落PCR驗證Fig．2 Colony PCR verification of E.coli W3110-glpR:: Kan and E.coli W3110-ΔglpR

2.1.2 工程菌株E.coliW3110ΔglpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)的篩選和驗證

將pACYCDuet- tac-dhaB1-4質(zhì)粒和pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliW3110ΔglpR的感受態(tài)細(xì)胞中，采用引物dhaB1-4-F/dhaB1-4-R和K-F/K-R進(jìn)行菌落PCR驗證，結(jié)果如圖3所示，菌落PCR擴(kuò)增出約4714 bp的dhaB1-4(圖3A)和1 454 bp的TUkgsadh(圖3B)基因，陽性對照是為以K.pneumoniaeDSM 2026基因組和pET-28(b)-TUkgsadh為模板擴(kuò)增的結(jié)果，通過比對大小一致，這說明獲得了敲除了glpR基因的工程菌RH002，即E.coliW3110 ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)。

A: M -5 000bp marker; control -陽性對照;條帶1～3-工程菌株RH002 dhaB1-4基因菌落PCR結(jié)果 B: M-5 000bp marker; control -陽性對照;條帶1～3-工程菌株RH002 TUkgsadh基因菌落PCR結(jié)果圖3 工程菌E.coli W3110ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)菌落PCR驗證Fig.3 Colony PCR verification of E.coli W3110ΔglpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)

2.2yqhD基因敲除菌株的構(gòu)建與驗證

2.2.1 篩選陽性克隆E.coliW3110ΔyqhD

乙醛脫氫酶基因yqhD基因的敲除是以E.coliK12-yqhD::kan基因組DNA為模版，利用PCR擴(kuò)增出和yqhD基因含有相同的上下同源臂的yqhD::kan打靶片段并進(jìn)行純化；然后制備含有pKD46的E.coliW3110電轉(zhuǎn)感受態(tài)，再將純化后的打靶片段通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到E.coliW3110中，經(jīng)菌落PCR驗證，如圖4A所示，片段1～3大小與陽性對照一致，證明Kan抗性成功替代了E.coliW3110菌株染色體上醛脫氫酶的基因位置；之后通過導(dǎo)入pCP20質(zhì)粒消除Kan抗性，經(jīng)菌落PCR后，結(jié)果如圖4B所示，理論上卡那抗性基因消除的菌株經(jīng)過敲除引物擴(kuò)增，僅有同源臂距離大小，約450 bp左右，結(jié)果顯示條帶2，4，5大小與理論相符合，因而可以確定該菌株中的卡那抗性消除，通過測序，最終確定該菌株為E.coliW3110ΔyqhD。

A: M-2 000bp marker; control -陽性對照; 條帶1～3 -yqhD::kan打靶片段的菌落PCR結(jié)果 B:M -5 000bp marker; control -陰性對照; 條帶1～5-敲除yqhD基因的菌落PCR結(jié)果圖4 E.coli W3110-yqhD::kan和E.coli W3110Δ yqhD菌落PCR驗證Fig.4 Colony PCR verification of E.coli W3110-yqhD::Kan and E.coli W3110-ΔyqhD

2.2.2 工程菌株E.coliW3110ΔyqhD(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)的篩選和驗證

將pACYCDuet- tac-dhaB1-4質(zhì)粒和pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliW3110ΔyqhD的感受態(tài)細(xì)胞中，采用引物dhaB1-4-F/dhaB1-4-R和K-F/K-R進(jìn)行菌落PCR驗證，結(jié)果如圖5所示，菌落PCR擴(kuò)增出約4 714 bp的dhaB1-4(圖5A)和1 454 bp的TUkgsadh(圖5B)基因，陽性對照是為以K.pneumoniaeDSM 2026基因組和pET-28(b)-TUkgsadh為模板擴(kuò)增的結(jié)果，通過比對大小一致，這說明獲得了敲除了yqhD基因的工程菌RH003，即E.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)。

A: M -5 000bp marker; control -陽性對照;條帶1,2-工程菌株RH003 dhaB1-4基因菌落PCR結(jié)果B: M-2 000 bp marker; control -陽性對照;條帶1,2-工程菌株RH003 TUkgsadh基因菌落PCR結(jié)果圖5 工程菌E.coli W3110Δ yqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)菌落PCR驗證Fig．5 Colony PCR verification of E.coli W3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)

2.3工程菌的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)3-HP

將原始工程菌RH001(dhaB1-4,gpd1-TUkgsadh)以及敲除glpR和yqhD的工程菌株RH002(ΔglpR,dhaB1-4,gpd1-TUkgsadh)和RH003(ΔyqhD,dhaB1-4,gpd1-TUkgsadh)以相等的OD值分別接種到含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在37 ℃，150 r/min條件下生長至OD600值為0.6時，加入0.05 mmol/L IPTG，28 ℃誘導(dǎo)，定時取樣測定OD計算干重和3-HP及其他副產(chǎn)物的產(chǎn)量。如圖6所示，由于基因缺失，RH002和RH003的菌體量均低于原始菌株。相比3-HP產(chǎn)量，發(fā)酵35 h后RH002產(chǎn)量達(dá)到2.86 g/L，比RH001(0.43 g/L)提高了6.7倍，3-HP得率為0.19 g/g甘油。RH003產(chǎn)量達(dá)到2.53 g/L，比RH001提高了5.8倍，3-HP得率為0.20 g/g甘油。同時，RH001的副產(chǎn)物主要有乙酸(0.24 g/L)、乳酸(0.29 g/L)、甲酸(1.22 g/L)和1,3-PDO(1.24 g/L)，敲除glpR基因的RH002中乳酸已低于檢測限，其他副產(chǎn)物乙酸(0.08 g/L)、甲酸(1.18 g/L)和1,3-PDO(0.86 g/L)也有明顯降低，而敲除yqhD基因的RH003中1,3-PDO不再生成，其他副產(chǎn)物乙酸(0.05 g/L)、乳酸(0.01 g/L)也顯著降低(結(jié)果未列出)。上述結(jié)果說明敲除副產(chǎn)物和旁支途經(jīng)可以有效地提升目的產(chǎn)物3-HP的產(chǎn)量并降低副產(chǎn)物的量。

圖6 搖瓶發(fā)酵工程菌株RH001, RH002 and RH003的細(xì)胞干重(A)和3-HP產(chǎn)量(B)Fig 6 The dry cell weight (A) and 3-HP production (B) of recombinants RH001, RH002 and RH003

2.4工程菌株5L罐發(fā)酵生產(chǎn)3-HP

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的實驗中，菌株RH002獲得了較高的3-HP產(chǎn)量，為了進(jìn)一步檢測RH002產(chǎn)3-HP的能力，在含有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)控制pH 7.0(如圖7)，初始甘油質(zhì)量濃度為30 g/L，補料時加入質(zhì)量濃度為500 g/L的甘油以維持發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度，經(jīng)過45 h的發(fā)酵培養(yǎng)，RH002的3-HP產(chǎn)量達(dá)到了15.4 g/L，甘油消耗量為34.98 g/L，3-HP的產(chǎn)率達(dá)到0.44 g/g甘油，比RH001在搖瓶中的得率顯著提高。由此可知，glpR的敲除能夠提高甘油易化蛋白的活性，促進(jìn)胞內(nèi)的甘油能夠更多地用于菌體生長和3-HP的合成。

圖7 工程菌RH002在5L罐發(fā)酵中的發(fā)酵曲線Fig7 Fermentation curve of recombinants RH002 in 5 L bioreactor

3 結(jié)論

實驗室前期構(gòu)建了利用甘油合成3-HP的重組大腸桿菌，本實驗在此基礎(chǔ)上采用同源重組的方法，敲除了甘油代謝過程中的甘油抑制因子glpR以及合成副產(chǎn)物1,3-丙二醇的主要基因yqhD，經(jīng)過抗性篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過PCR和測序驗證，證明2個基因分別被敲除，獲得了重組菌株RH002和RH003。實驗結(jié)果表明兩個基因的敲除明顯改變了甘油的利用率和副產(chǎn)物的代謝途徑，提高了3-HP的產(chǎn)量。特別是在敲除甘油抑制因子glpR后，菌體更快達(dá)到穩(wěn)定期，使得3-HP在5 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到15.4 g/L，甘油利用率0.44 g /g甘油。后續(xù)的研究將集中于調(diào)節(jié)優(yōu)化酶的表達(dá)，輔酶再生和優(yōu)化工藝過程，更加有效的提升3-HP的產(chǎn)量。

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MetabolicengineeringofEscherichiacolifor3-hydroxypropionicacidproduction

CHENG Xiu-li1, 2, QIN Hai-bin1, 2, XIONG Tao1, 2, NIU Kun1, 2*

1 (Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China) 2 (Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

3-Hydroxypropionic acid (3-HP) is an important platform chemical that can be used to synthesize a range of chemical compounds. To improve 3-HP production, theE.coliW3110ΔyqhD (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) was genetically modified by homologous recombination technology to knockout acetaldehyde dehydrogenase (yqhD). The recombinant strain produce 2.53 g/L 3-HP of flask culture, the production was increased 5.8 times compared with original one. On the other hand, theE.coliW3110ΔglpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) was genetically modified to knockout glycerol regulatory factor (namedglpR). The recombinant strain produces 2.86 g/L 3-HP of flask culture, which was 6.7 times higher than that of the original strain. Finally, the strain ofE.coliW3110?glpR (pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4) could produce 15.4 g/L 3-HP in a 5-L fermentor. The results provide research basis for 3-HP production.

3-hydroxypropionic acid (3-HP); glycerol metabolism; gene knockout; recombinantEscherichiacoli

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014181

碩士研究生(牛坤副教授為通訊作者,E-mail:niukun@zjut.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(21306173)；浙江省自然科學(xué)基金青年基金(LQ15C010001)

2017-03-01，改回日期：2017-03-23