堿性蛋白酶抑制劑lupI-MSSS原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白表達(dá)、純化

王昆，梁朋娟，李尚勇，王偉，孫晶晶，劉均忠，孫謐，郝建華*

1(農(nóng)業(yè)部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海洋國家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島，266071)2(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)

堿性蛋白酶抑制劑lupI-MSSS原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白表達(dá)、純化

王昆1,2，梁朋娟1，李尚勇1，王偉1，孫晶晶1，劉均忠1，孫謐1，郝建華1*

1(農(nóng)業(yè)部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海洋國家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島，266071)2(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)

低溫堿性金屬蛋白酶MP是從菌株YS-80-122中提取純化的，屬于沙雷氏蛋白酶家族，與該家族報(bào)道的其他酶的結(jié)構(gòu)類似，在MP基因下游有一抑制劑基因lupI，該抑制劑可以完全抑制蛋白酶MP的活性。在野生型抑制劑基因的基礎(chǔ)上，通過定點(diǎn)突變將LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，命名為LupI-MSSS，通過構(gòu)建pET28a-lupI-MSSS原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明該蛋白的大小約11 kDa, 與預(yù)測的蛋白分子量一致。對影響蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)溫度、異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 濃度、誘導(dǎo)時間4個因素進(jìn)行優(yōu)化，并經(jīng)初步優(yōu)化得到了其誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：接種量2%，誘導(dǎo)劑添加時間3 h，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時間為8 h。表達(dá)的蛋白依次通過超濾，Superdex 200凝膠過濾層析，Q-Sepharose離子交換層析進(jìn)行純化，結(jié)果顯示目的蛋白純化倍數(shù)為20，比活力為15 720 U/mg，活性回收率達(dá)60.7%，純化后的lupI通過高效液相色譜法進(jìn)行純度分析，其純度可達(dá)99%以上。

蛋白酶抑制劑；原核表達(dá)；蛋白純化

蛋白酶是催化肽鍵水解的常用研究和工業(yè)用酶，是繼淀粉酶之后一種新的在全世界廣泛應(yīng)用的酶制劑(主要應(yīng)用在食品、制革、日化和醫(yī)藥行業(yè)等)[1-2]。沙雷氏蛋白酶是一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的胞外分泌蛋白，特別是沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬和假單胞桿菌屬中[3]。在研究不同種類沙雷氏蛋白酶的過程中發(fā)現(xiàn)：這類蛋白酶基因附近都有一段抑制其酶活性的抑制劑基因[4]該抑制劑的基因與蛋白酶基因在基因組序列中處于緊鄰的位置，屬于同一個分泌體。該抑制劑蛋白分子量一般在11.5 kDa左右，存在于周質(zhì)空間，在蛋白酶分泌過程中保護(hù)有機(jī)體不被體外分解[5]。

海洋細(xì)菌YS-80是本研究團(tuán)隊(duì)從黃海水樣中分離到的1株高產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的菌株。對YS-80所產(chǎn)的主要的堿性蛋白酶進(jìn)行了分離純化，將其命名為MP，并對其進(jìn)行了詳細(xì)的性質(zhì)研究，在此基礎(chǔ)上對編碼MP的基因進(jìn)行了克隆[6]。該蛋白酶MP屬于沙雷氏蛋白酶家族，通過蛋白序列和晶體結(jié)構(gòu)比較獲得該蛋白酶MP與沙雷氏蛋白酶家族的氨基酸同源性最高達(dá)83%。并通過懸滴法獲得了該蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)[7]。另外，實(shí)驗(yàn)室在前期擴(kuò)增MP基因lupA的過程中也獲得了1個抑制劑基因序列l(wèi)upI,該基因位于蛋白酶MP基因下游，lupI與現(xiàn)有沙雷氏蛋白酶抑制劑APRin的同源性僅為40.9%。抑制劑lupI可完全抑制蛋白酶MP的活性，但是其在胞內(nèi)的確切生物功能還不清楚[6,8]。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[9],具有遺傳背景清楚、代謝調(diào)控技術(shù)成熟、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)成本低、生長周期短等特點(diǎn),在重組蛋白質(zhì)外源基因表達(dá)系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)地位[10]。為進(jìn)一步探究N端序列延伸后對抑制劑活性的影響，在野生型抑制劑基因的基礎(chǔ)上，通過定點(diǎn)突變將LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，本文主要通過構(gòu)建pET28a-lupI-MSSS原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)，通過單因素試驗(yàn)對該抑制劑的發(fā)酵表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定較優(yōu)的誘導(dǎo)表達(dá)條件。并對蛋白進(jìn)行純化，以滿足后續(xù)試驗(yàn)研究的要求。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌株FlavobacteriumSP. YS-80-122由本研究團(tuán)隊(duì)自黃海水域獲得并鑒定保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,Omega；大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,康為世紀(jì)有限公司；pET28a表達(dá)載體菌株，康為世紀(jì)有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒，康為世紀(jì)有限公司；卡那霉素(kanamycin, Kana)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，Sigma公司；蛋白胨(Tryptone)和酵母粉(Yeast Extract)，英國Oxoid公司；Color Prestained Protein Marker，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；其他試劑,分析純，國藥集團(tuán)。

定性梯度PCR儀，德國Biometra公司；SHIMADZU UV-2550島津分光光度計(jì)，日本島津公司；SW-CJ型超凈工作臺，中外合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；20PR-52D高速冷凍離心機(jī)，日立公司；LKB2219恒溫水浴，瑞典BROMMA公司；JY96-ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科技生物股份有限公司；超濾杯，美國默克公司；Bio-Rad Mini III蛋白電泳儀，美國伯樂公司；高效液相色譜儀，美國waters公司；快速液相色譜儀，美國通用電氣。

1.2方法

1.2.1 溶液配制

100 mg/mL Kana貯存液配制：1 g Kana溶于10 mL雙蒸水中，0.22 μm 的濾膜過濾除菌，分裝后于-20 ℃保存。

1 mol/L IPTG貯存液配制：2.38 g IPTG溶于10 mL雙蒸水中，0.22 μm的濾膜過濾除菌，分裝后于-20 ℃保存。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%。LB固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基+瓊脂2%。

1.2.2 抑制劑蛋白濃度的測定

采用Bradford法[11]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3 lup-MSSS抑制活性測定

粗酶液的制備：蛋白酶MP酶粉0.5 g溶解在10 mL水中，10 000 r/min離心30 min，上清稀釋200倍為待測酶液。

抑制劑溶液制備：表達(dá)后的抑制劑按菌液體積的1/10加入50 mmol/L的Tris-HCl(pH8.0),200 W超聲破碎，10 000 r/min離心15 min后留上清。稀釋5倍，為抑制劑溶液。

活性測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009，具體如下：1 mL酶液與10 μL抑制劑混勻30 ℃靜置10 min；實(shí)驗(yàn)對照為1 mL酶液加10 μL水混勻。加入1 mL含1%的酪素溶液，30 ℃水浴10 min，2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，靜置過濾；空白對照加樣順序?yàn)椋好敢?TCA-酪素。取濾后溶液1 mL加0.4 mol/L NaCO3溶液5 mL、福林試劑1 mL，混勻，置于40 ℃水浴中顯色20 min取出，冷卻至室溫，680 nm波長下比色。以稀釋后的粗酶液1mL作為標(biāo)準(zhǔn)，以每毫升酶液在30 ℃、pH 7.0條件下水解酪蛋白，每分鐘釋放1 μg酪氨酸所含的酶量定義為1個酶活單位。抑制劑抑制活性用實(shí)驗(yàn)對照組酶活與加抑制劑組酶活差值表示。

1.2.4 PCR擴(kuò)增基因片段

利用定點(diǎn)突變試劑盒設(shè)計(jì)合成兩端引物，以LupI野生型表達(dá)質(zhì)粒pET28-lupI為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得編碼抑制劑LupI-MSSS的目的基因片段。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)32次，最后72 ℃再延伸10 min。用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。

1.2.5 pET28a-lupI-MSSS原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將上述PCR擴(kuò)增得到的基因片段和pET28a原核表達(dá)載體分別用NcoI和SalI兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切，然后進(jìn)行電泳分離并切膠回收。利用無縫克隆試劑盒對酶切后的lupI-MSSS基因片段和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行連接。涂布含卡那霉素的LB平板，篩選轉(zhuǎn)化子。挑取6個單克隆，在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集菌體。提取質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證。

1.2.6 抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中的表達(dá)

將pET28a-lupI-MSSS重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)。挑取單克隆，在含有40 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h，1%接種量轉(zhuǎn)接至兩個三角瓶培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，一瓶加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG，37℃誘導(dǎo)，另一瓶不加IPTG作為對照，均繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心，收集細(xì)胞。加入50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液懸浮細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞，離心，棄沉淀，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.7 抑制劑LupI-MSSS誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

1.2.7.1 誘導(dǎo)劑添加時間對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

按2%接種量接種，在37 ℃，200 r/min的條件下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h，加入誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并在每個時間段取樣測大腸桿菌的菌濃OD600值，誘導(dǎo)完成后收集菌體，超聲破碎后取上清檢測，確定最佳誘導(dǎo)時間。

1.2.7.2 誘導(dǎo)劑濃度對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

按2%接種量接種，在最佳誘導(dǎo)時間加入誘導(dǎo)劑IPTG，調(diào)整使其終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L，誘導(dǎo)完成后收集菌體，超聲破碎后取上清檢測，分析不同終濃度的誘導(dǎo)劑對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響，確定最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1.2.7.3 誘導(dǎo)溫度對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

按2%接種量接種，在最佳誘導(dǎo)時間加入誘導(dǎo)劑IPTG，調(diào)整使其終濃度為上述最佳誘導(dǎo)濃度，設(shè)置誘導(dǎo)溫度分別為16、20、27、32、37、42、45 ℃，誘導(dǎo)完成后收集菌體，超聲破碎后取上清檢測，確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.7.4 誘導(dǎo)時間對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

按2%接種量接種，在最佳誘導(dǎo)時間加入誘導(dǎo)劑IPTG，調(diào)整使其終濃度為最佳誘導(dǎo)濃度，在上述最佳溫度條件下分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12 h,誘導(dǎo)完成后收集菌體并破碎細(xì)胞，檢測抑制劑活性，確定最佳誘導(dǎo)時間。

1.2.8 抑制劑LupI-MSSS純化[12,13]

1.2.8.1 超濾

先用30 kDa的超濾膜收集濾出液，再用3 kDa超濾膜收集濃縮液，濃縮后樣品通過SDS-PAGE檢測[14]。

1.2.8.2 Superdex 200凝膠過濾層析

采用Superdex 200 pg 26/600凝膠柱，用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)預(yù)平衡。將上述經(jīng)超濾所得蛋白液過0.45 μm的濾膜，進(jìn)行上樣，上樣量10 mL。同樣的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速1 mL/min,檢測波長為280 nm。分部收集洗脫后的溶液，測定與蛋白峰相對應(yīng)的洗脫液的抑制活性，確定抑制活性最高的那部分洗脫液。

1.2.8.3 Q-Sepharose離子交換層析

采用Q-Sepharose FF, 20 mL層析柱，用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)預(yù)平衡10個柱體積。將上述經(jīng)Superdex 200凝膠過濾層析所得蛋白液過0.45 μm的濾膜，上樣，上樣量5 mL。用同樣的緩沖液先將那些未吸附在層析柱上的蛋白洗脫出來；然后用1 mol/L NaCl溶液(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液配制，pH 8.0)對吸附在層析柱的蛋白進(jìn)行梯度洗脫，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm。分部收集洗脫后的溶液，測定與蛋白峰相對應(yīng)的洗脫液的抑制活性，確定活性峰。

1.2.9 抑制劑LupI-MSSS純度測定

利用高效液相色譜法對純化后的樣品進(jìn)行純度分析。利用TSK3000SW凝膠過濾柱，在波長280 nm處檢測。流動相為100 mmol/L的磷酸緩沖液,100 mmol/L Na2SO4,pH 6.5,流速為0.6 mL/min[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1抑制劑LupI-MSSS原核表達(dá)載體的構(gòu)建

pET28a-LupI-MSSSBL21擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行NcoI和SalI雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。其中泳道1為陽性質(zhì)粒pET28a-LupI-MSSS酶切電泳結(jié)果，可以看出，酶切后表達(dá)片斷大小約為363 bp，與預(yù)期大小相符。

1-LupI-MSSS質(zhì)粒 M-DNA 1 kb ladder圖1 LupI-MSSS質(zhì)粒酶切圖Fig.1 dentification of plasmid recombinant by restriction digesting

2.2抑制劑LupI-MSSS誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

pET28a-LupI-MSSS重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)，菌液離心棄上清，沉淀重懸超聲破碎后，SDS-PAGE電泳檢測，如圖2所示，2泳道中明顯有1條11 kDa左右的條帶，與預(yù)測蛋白分子量相符，未加IPTG誘導(dǎo)的1幾乎沒有。而活性測定也表明2有活性，1沒有抑制活性，說明抑制劑LupI-MSSS重組表達(dá)成功。

M-蛋白Marker；1-非誘導(dǎo)上清；2-IPTG誘導(dǎo)上清圖2 LupI-MSSS在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of LupI-MSSS expressed by E．coli

2.3單因素法優(yōu)化LupI-MSSS表達(dá)條件

2.3.1 誘導(dǎo)劑添加時間對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

誘導(dǎo)劑添加時間與菌體生長密度有關(guān)，誘導(dǎo)劑添加的過早，IPTG會抑制菌體增殖，細(xì)菌從生長階段進(jìn)入表達(dá)階段，但由于菌體密度較低，因而蛋白表達(dá)量不高。誘導(dǎo)劑添加的越晚，菌體密度越高，但菌體相對較老，蛋白表達(dá)效率也會降低。如圖3所示，當(dāng)OD600在0.8左右時，即發(fā)酵液培養(yǎng)2 h后添加誘導(dǎo)劑IPTG時，相對抑制活性處于較高水平，之后隨著時間的延長，抑制活性逐漸降低。因此，本試驗(yàn)確定誘導(dǎo)劑IPTG應(yīng)在發(fā)酵液培養(yǎng)后的2 h(OD600=0.8)時添加。

圖3 誘導(dǎo)劑添加時間對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響Fig.3 The effects of IPTG addition time on the activity of LupI-MSSS

2.3.2 誘導(dǎo)劑濃度對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

誘導(dǎo)劑IPTG的濃度與蛋白表達(dá)的速度相關(guān)，在一定范圍內(nèi)高濃度的IPTG會加快蛋白的表達(dá)，但是IPTG具有一定的細(xì)胞毒性，濃度過高時會降低細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞增殖。從圖4中可以看出,當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度在0.4～0.6 mmol/L范圍內(nèi)，抑制活性維持在相對較高的水平，當(dāng)誘導(dǎo)劑終濃度為0.5 mmol/L時的相對抑制活性最大，因而確定添加誘導(dǎo)劑的終濃度為0.5 mmol/L。

圖4 誘導(dǎo)劑濃度對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響Fig.4 The effects of IPTG concentration on the activity of LupI-MSSS

2.3.3 誘導(dǎo)溫度對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

在誘導(dǎo)表達(dá)時，較低的溫度下菌體生長緩慢，蛋白表達(dá)的速率低，蛋白表達(dá)的時間延長。升高溫度，菌體生長速度加快，表達(dá)速率提高，但溫度過高時蛋白的表達(dá)受到抑制。如圖5所示，37 ℃誘導(dǎo)時，LupI-MSSS表達(dá)量明顯高于其他幾個溫度的表達(dá)量，故IPTG誘導(dǎo)抑制劑LupI-MSSS表達(dá)的最優(yōu)溫度選擇37 ℃。

圖5 誘導(dǎo)溫度對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響Fig.5 The effects of induction temperature on the activity of LupI-MSSS

2.3.4 誘導(dǎo)時間對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響

考察不同誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖6所示，當(dāng)誘導(dǎo)時間為2～8 h時，菌體密度逐漸升高，蛋白合成旺盛，抑制劑活性隨誘導(dǎo)時間的延長而提高，在8 h時達(dá)到最高值，當(dāng)誘導(dǎo)時間超過8 h時，菌體由于生長時間過長而衰退，抑制活性開始逐漸降低，確定8 h作為該基因工程菌的最佳誘導(dǎo)時間。

圖6 誘導(dǎo)時間對LupI-MSSS產(chǎn)量的影響Fig.6 The effects of induction time on the activity of LupI-MSSS

2.4抑制劑LupI-MSSS純化結(jié)果

2.4.1 超濾

經(jīng)過30 kDa濾膜過濾后，分子量較大的大部分雜蛋白被除去,用3 kDa超濾膜進(jìn)行濃縮，發(fā)現(xiàn)仍有少量雜蛋白存在。

2.4.2 Superdex 200凝膠過濾層析

超濾濃縮后的樣品過0.45 μm濾膜，用于Superdex 200凝膠過濾層析進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，洗脫結(jié)果如圖7所示，分部收集后的活性測定結(jié)果表明，只有第2個峰具有抑制活性。

圖7 Superdex 200凝膠過濾層析Fig.7 Superdex 200 gel filtration chromatography

2.4.3 Q-Sepharose離子交換層析

Superdex 200凝膠過濾層析后的活性峰樣品過0.45 μm濾膜，用于Q-Sepharose離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步的純化。如圖8所示，僅洗脫峰1有活性，目的蛋白的洗脫收集條件為0.6 mol/L NaCl。

圖8 Q-Sepharose離子交換層析Fig.8 Q-Sepharose ion exchange chromatography

2.4.4 抑制劑LupI-MSSS純化結(jié)果[12,16]

對LupI-MSSS粗蛋白進(jìn)行3步純化：超濾，Superdex 200凝膠過濾層析，Q-Sepharose離子交換層析，結(jié)果如表1所示，目的蛋白純化倍數(shù)為20，比活力為15 720 U/mg,活性回收率為60.7%。

表1 大腸桿菌表達(dá)LupI-MSSS的純化結(jié)果

2.4.5 SDS-PAGE電泳

1-粗蛋白；2-30 kDa濾出液；3-3 kDa濃縮液；4-Superdex 200；5-Q-Sepharose圖9 LupI-MSSS純化的SDS-PAGE結(jié)果Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified LupI-MSSS

2.4.6LupI-MSSS純度鑒定結(jié)果[15]

對純化后的LupI-MSSS進(jìn)行蛋白質(zhì)純度檢測。在1.2.9色譜條件下，取驗(yàn)證試驗(yàn)洗脫峰樣品溶液進(jìn)樣20 μL,保存色譜峰圖。根據(jù)峰面積歸一法，計(jì)算抑制劑LupI-MSSS的純度。蛋白酶抑制劑LupI-MSSS經(jīng)過高效液相色譜法檢測后的純度結(jié)果如圖10。抑制劑LupI-MSSS表現(xiàn)為單一的色譜峰，峰型較為對稱，分離純度較好。經(jīng)過峰面積歸一法計(jì)算，其純度高達(dá)99.7%。

圖10 HPLC法純度檢測結(jié)果Fig.10 HPLC analysis of the purified lupI

3 結(jié)果與討論

本文將擴(kuò)增得到的編碼LupI-MSSS的目的基因片段和pET28a原核表達(dá)載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明，該蛋白的大小約11 kDa,與預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量一致。為提高LupI-MSSS的表達(dá)量，對影響蛋白表達(dá)的幾個主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)初步優(yōu)化得到了其誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：誘導(dǎo)劑添加時間3 h，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時間為8 h。在該條件下，抑制劑LupI-MSSS表達(dá)量較高，可發(fā)酵表達(dá)供后續(xù)純化。對表達(dá)后的抑制劑進(jìn)行純化，純化的步驟為：超濾，Superdex 200凝膠過濾層析，Q-Sepharose離子交換層析，3步純化后目的蛋白純化倍數(shù)為20，活性回收率達(dá)60.7%，純度達(dá)99%以上，達(dá)到較好的預(yù)期純化效果，且回收率較高。

對沙雷氏蛋白酶這一類酶與抑制劑相互作用研究較多的是一種來源于假單胞桿菌的堿性蛋白酶APR與其抑制劑APRin形成一個緊密結(jié)合的復(fù)合物[8]。通過研究這一復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)酶與抑制劑有兩個結(jié)構(gòu)在空間上相互接觸，一個是連接抑制劑β折疊片IV和V之間的loop環(huán)連接，它與酶的Met轉(zhuǎn)角區(qū)相互接觸。另一個是N端trunk結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)幾乎成直線狀伸入蛋白酶的β桶結(jié)構(gòu)，并占據(jù)了酶的活性中心，阻止其他多肽底物進(jìn)入酶的活性中心，從而抑制該蛋白酶的活性[17-18]。本研究制備了該抑制劑的高純度蛋白，為進(jìn)一步進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供了扎實(shí)的技術(shù)儲備。在此基礎(chǔ)上，開展晶體優(yōu)化培養(yǎng)、蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)和基因功能機(jī)制研究，將對我們揭示酶與抑制劑相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和深入了解沙雷氏蛋白酶的分泌調(diào)控機(jī)理發(fā)揮重要作用。

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ConstructionofprokaryoticexpressionvectorforexpressionandpurificationofinhibitorlupI-MSSS

WANG Kun1,2,LIANG Peng-juan1,LI Shang-yong1,WANG Wei1, SUN Jing-jing1,LIU Jun-zhong1,SUN Mi1,HAO Jian-hua1*

1(Key Laboratory of Polar Fisheries Development, Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences Qingdao 266071, China) 2(College of Food Sciences & Technology,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The alkaline metalloproteases MP is extracted from the strain YS-80-122 and belongs to the family of serralysin. Similarly to the other enzymes of this family reported before,there is an inhibitor genelupIdownstream of the MP gene andLupIcan completely inhibit the activity of MP.On the basis of the wild-type inhibitor gene, four amino acids were added to the N-terminus ofLupI, namedLupI-MSSS.This work aims to construct a prokaryotic expression vector forLupI-MSSS, the recombinant plasmid was transformed to BL21 (DE3), and the expression was induced by IPTG. The recombinationLupI-MSSSwas separated using SDS-PAGE and the size of expressedLupI-MSSSwas consistent with the prediction. Single factor experiment were used to optimize the fermentation condition and the optimal conditions were :the inoculation amount is 2 %, IPTG as the induced agent was added at 3 h after inoculating, and it's final concentration is 0.5 mmol/L, the recombined E.coli need inducing 8 hours at 37 ℃.Consecutive steps were used to achieve the purified protein as follows: ultrafiltration, Q Sepharose ion exchange, Superdex 200 gel filtration, and the purity of LupI-MSSS is up to 99%.

inhibitor of protease; prokaryotic expression; purification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014069

碩士研究生(郝建華研究員為通訊作者,E-mail:haojh@ysfri.ac.cn)。

國家自然科學(xué)基金(41376175)；國家實(shí)驗(yàn)室-鰲山科技計(jì)劃(2016ASKJ14)

2017-02-16，改回日期：2017-04-09