耐高溫葡萄糖異構酶重組菌發(fā)酵與轉化條件研究

賈東旭，周霖，王騰，於淳安，廖承軍，陳德水，王紅艷，廖小穎，金利群*

1(浙江工業(yè)大學，浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室，浙江 杭州，310014) 2(浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 開化，324032)

研究報告

耐高溫葡萄糖異構酶重組菌發(fā)酵與轉化條件研究

賈東旭1，周霖1，王騰1，於淳安1，廖承軍2，陳德水2，王紅艷2，廖小穎2，金利群1*

1(浙江工業(yè)大學，浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室，浙江 杭州，310014) 2(浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 開化，324032)

耐高溫的葡萄糖異構酶(glucose isomerase，GI)在高溫下可將D-葡萄糖異構化為D-果糖，獲得的高果糖漿可作為甜味劑應用于食品諸多領域。對ThermusoshimaiGI重組菌發(fā)酵產酶條件和全細胞轉化D-葡萄糖生成D-果糖工藝進行研究。確定誘導溫度28 ℃，誘導劑終濃度0.1 mmol/L，發(fā)酵培養(yǎng)基添加5 mmol/L Mn2+的最優(yōu)產酶發(fā)酵條件；將最優(yōu)轉化體系放大，包括20 g/L濕菌體、10 mmol/L Mn2+和200 g/L底物，于95 ℃和pH 7.5條件下生物轉化4 h，D-果糖得率高達57.34%。該工藝具備一步法生產F55型高果糖漿的可能性，可簡化后續(xù)濃縮分離等步驟，為進一步使用食品安全的表達系統(tǒng)生產F55型高果糖漿提供理論依據(jù)。

Thermusoshimai葡萄糖異構酶；工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI；D-葡萄糖；D-果糖；細胞催化轉化

高果糖漿(high fructose corn syrup，HFCS)是由葡萄糖和果糖組成的一種混合物糖漿，是重要的甜味劑[1]。具有甜味純正、溶解度高、滲透壓強和與其他添加劑混合不影響食品風味等優(yōu)勢，已廣泛應用于飲料、烘焙、罐頭和調味品等食品行業(yè)[2]。根據(jù)高果糖漿中果糖含量，將其分為HFCS-42型、HFCS-55型和HFCS-90型3種[3]。由于HFCS-42果糖含量低，醫(yī)療和保健價值不能得到充分發(fā)揮，且在低溫貯運時易結晶析出[4]，因此，具有更高果糖濃度的HFCS-55成為主流產品。

制備HFCS-55的工藝流程是濃縮HFCS-42至HFCS-90，再與HFCS-42勾兌而成HFCS-55[5]。目前，國內外已有一些固定化GI催化合成D-果糖的報道。AMOTZ等報道了固定化的BacilluscoagulansGI在60 ℃和底物濃度400 g/L等條件下反應44 h，轉化率為45.2%[6]。SKOET等報道了固定化StreptomycesmurinusGI催化合成D-果糖的應用，當?shù)孜餄舛葹?50 g/L、溫度為60 ℃、pH 7.5等條件下，通過調節(jié)糖漿流經(jīng)管道的流速，可以獲得41%～44.5%的D-果糖[7]。

上述所用GI均不是超級嗜熱酶，催化溫度僅能維持在60～65 ℃。BHOSALE等提出，隨著溫度升高催化平衡向果糖方向進行，可以獲得更高果糖濃度的HFCS[8]?；谠撍悸罚绻軌蚝Y選到耐高溫GI，在85 ℃以上的催化溫度進行生物轉化，便可一步生產HFCS-55型高果糖漿，并大大降低后續(xù)的分離和濃縮成本。截止目前，已有很多耐高溫GI的報道，例如ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumGI[9]、AnoxybacillusgonensisG2TGI[10]和ThermoanaerobacteriumthermosulfurigeneGI[11]。本實驗室已在NCBI數(shù)據(jù)庫中挖掘篩選到新型耐高溫酶ThermusoshimaiGI(ToGI)，其最適溫度為95 ℃，添加20 mmol/L Mn2+于85 ℃保溫48 h，仍維持80%以上酶活，性能明顯優(yōu)于已報道的耐高溫酶[12]。

基因工程菌發(fā)酵主要目標是獲取高產外源基因表達蛋白，這不僅與工程菌本身的遺傳性狀有關，還與發(fā)酵工藝的控制有著非常重要的關系。為了提高基因工程菌的產酶水平，需要確定最適的發(fā)酵產酶條件，并以此為基礎，進行重組菌的催化研究[13]。微生物全細胞催化實質為生物體系中酶的催化。生物催化過程中外界環(huán)境的變化會對酶的空間構象造成影響，進而影響催化表現(xiàn)[14]。因此，需要對催化過程產生影響的溫度、體系pH、底物濃度、催化劑用量等因素進行系統(tǒng)研究，以達到高底物濃度和高產物轉化率的目標。

本研究在已篩選到耐高溫酶ToGI的基礎上，首先優(yōu)化重組工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI的發(fā)酵產酶條件，包括誘導溫度、誘導劑濃度等；然后利用其全細胞作為生物催化劑，確定影響催化合成D-果糖的關鍵因素，以確定最優(yōu)轉化體系，最終將D-果糖得率提高至55%以上。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

表達ToGI的重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI由本實驗室構建并保存。

D-葡萄糖,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D-果糖,北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素(Kanamycin，Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG),上海生工生物工程股份有限公司；酵母粉和蛋白胨等,英國OXOID公司；氯化鎂購于上海市金山區(qū)興塔美興化工廠；其他實驗試劑為國產分析純。

1.2儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；超凈工作臺，蘇州中亞凈化設備有限公司；電子分析天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；電熱恒溫水浴鍋，德國julobo公司；高效液相色譜，美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1 培養(yǎng)基與發(fā)酵

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，加水補齊至1 000 mL。

種子培養(yǎng)：將重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI接入含有50 μg/mL Kan的上述LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)10 h，得到種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：將上述種子液按2%(v/v)接種量接入含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)至OD6000.6～0.8，然后按1.3.2的發(fā)酵條件誘導10 h，收集菌體備用。

1.3.2 發(fā)酵產酶條件

以酶活為考察指標，確定最佳發(fā)酵產酶條件。

(1)確定最佳誘導溫度

按1.3.1，將種子液接入含Kan的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)至OD6000.6～0.8，再將搖瓶分別放于25、28、30、32和34 ℃誘導表達10 h，收集菌體，進行酶活測定。

(2)確定最佳誘導劑用量

取上述最優(yōu)結果，在誘導產酶時，發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0.05、0.1、0.2、0.3和0.4 mmol/L IPTG，誘導表達10 h，收集菌體，進行酶活測定。

(3)確定發(fā)酵培養(yǎng)基中Mn2+的添加量

取上述最優(yōu)結果，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1、5、10、15和20 mmol/L的Mn2+，進行發(fā)酵產酶，收集菌體，進行酶活測定。

1.3.3 轉化條件研究

利用1.3.2中最優(yōu)的產酶條件發(fā)酵獲得菌體，進行如下生物轉化反應。

初始轉化體系包括：50 g/LD-葡萄糖、25 g/L濕菌體(1 g濕菌體含0.78 g水)，用50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4(pH 8.0)緩沖液補齊至10 mL。反應于85 ℃、150 r/min反應2 h，再置于冰上10 min終止反應；低溫離心，上清液進行D-果糖的HPLC檢測。優(yōu)化實驗按以下進行：

(1)確定轉化體系中Mn2+用量

在轉化體系中分別加入1、5、10、15和20 mmol/L的Mn2+，以不添加Mn2+為對照，其他同初始轉化體系，進行轉化實驗。

(2)確定最佳轉化溫度

取上述最優(yōu)結果，分別設定80、85、90、95和100 ℃的轉化溫度，其他同初始轉化體系，進行轉化反應。

(3)確定最佳轉化pH

取上述最優(yōu)結果，分別以pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4緩沖體系進行轉化反應，其他同初始轉化體系。

(4)確定最佳底物濃度

取上述最優(yōu)結果，分別在50、100、200、300、400和500 g/L的D-葡萄糖底物濃度下，進行生物轉化反應，其他同初始轉化體系。

(5)確定最佳催化劑用量

取上述最優(yōu)結果，分別添加10、15、20、25、30和40 g/L的濕菌體，進行生物轉化反應，其他同初始轉化體系。

1.3.4 GI酶活測定

測酶活體系包括：200 mmol/LD-葡萄糖、10 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Co2+、125 mg濕菌體，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液補齊至5 mL。異構化反應于85 ℃反應20 min，置于冰上10 min終止反應，離心吸取上清進行D-果糖的HPLC檢測。酶活定義：每分鐘生成1 μmolD-果糖所需的酶量定義為1個活力單位U。

1.3.5 HPLC分析D-果糖和D-葡萄糖含量

色譜柱Hypersil NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(依利特分析儀器有限公司，大連，中國)。Waters 2414示差折光檢測器。柱溫30 ℃，流動相80%(v/v)乙腈，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。D-果糖和D-葡萄糖出峰時間分別為8.73和10.39 min。

1.3.6D-果糖得率的計算

將生成D-果糖和底物D-葡萄糖初始濃度的百分比定義為D-果糖得率。

2 實驗結果

2.1重組菌發(fā)酵條件研究

2.1.1 確定最佳誘導溫度

誘導溫度是重組蛋白表達調控的關鍵因素之一，它對菌體生長速率及蛋白的可溶性表達等有著重要影響[15]。本研究考察誘導溫度對重組菌酶活的影響如圖1所示，當誘導溫度從25 ℃增加至28 ℃時，酶活升至最高的187.56 U/g；當誘導溫度繼續(xù)升高，酶活開始下降，酶活下降的原因可能是較高的誘導溫度導致目的蛋白合成速率過快，其不能正確折疊而形成包涵體[16]。因此，確定最佳誘導溫度為28 ℃。

圖1 誘導溫度對菌體酶活的影響Fig.1 Effect of inducing temperature on the activity of ToGI

2.1.2 確定最佳誘導劑用量

pET28b以T7啟動子來調控目的蛋白的表達。在緊鄰T7啟動子下游的lacⅠ序列編碼阻遏蛋白，IPTG能與其特異性結合，使阻遏蛋白構象發(fā)生變化，T7啟動子便可以驅動重組基因的轉錄[17]，因此，IPTG的添加量會影響外源蛋白的表達。本研究考察了IPTG濃度對重組菌產酶的影響，結果見圖2。當IPTG濃度從0.05 mmol/L升至0.4 mmol/L，酶活呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，其中IPTG濃度為0.1 mmol/L時，酶活最高為187.56 U/g。該結果說明初始發(fā)酵條件的IPTG濃度無需變動便能達到最優(yōu)表達量。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)時誘導劑濃度對菌體酶活的影響Fig.2 Effect of IPTG concentration on the activity of ToGI

2.1.3 確定發(fā)酵培養(yǎng)基中Mn2+的添加量

GI是金屬酶，根據(jù)GI酶的不同，添加Mg2+、Mn2+或Co2+等金屬離子對促進其折疊和提高催化性能具有顯著作用[18]。WU等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L Co2+時，ThermobifidafuscaGI的酶活高達41 U/mL，與未添加金屬離子的對照相比提高了約2倍[19]。本團隊已發(fā)現(xiàn)Mn2+對ToGI酶活具有最大促進作用，此研究進一步確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中Mn2+的最優(yōu)添加量，實驗結果見圖3。需要注意的是，按1.3.4測酶活時，不能添加Mg2+和Co2+，以排除酶活體系中金屬離子的影響。按上述最優(yōu)產酶條件，并且測酶活時無任何金屬離子，菌體酶活僅為57.28 U/g；當發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5 mmol/L Mn2+發(fā)酵，菌體酶活達到最高值231.02 U/g；當Mn2+濃度增加至20 mmol/L，酶活已下降，并且菌體呈現(xiàn)較分散的狀態(tài)，無法用于后續(xù)研究。因此，在不影響菌體生長的情況下，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5 mmol/L Mn2+以提高ToGI酶活力。

圖3 培養(yǎng)基中Mn2+濃度對菌體酶活的影響Fig.3 Effect of Mn2+concentration on the activity of ToGI

最終，確定E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI的發(fā)酵條件是誘導溫度28 ℃、IPTG 0.1 mmol/L、添加5 mmol/L Mn2+，發(fā)酵的菌體酶活達到231.02 U/g。楊瑞金等將ActinoplanesmissouriensisCICIM B0118GI在E.coliBL21 (DE3)中進行表達，通過研究影響產酶的因素，發(fā)酵液的最高酶活達到62.42 U/mL[20]。岳田利等通過優(yōu)化LactobacillusbrevisGI的發(fā)酵培養(yǎng)基，將總活力提高至80.5 U[21]。由于測定酶活的方法和酶活單位均不同，導致本實驗無法與報道的研究進行對比。但是，本研究已經(jīng)顯著提高了重組菌的酶活力，有利于接下來的催化研究。

2.2生物轉化條件研究

2.2.1 確定轉化體系Mn2+濃度

按1.3.3，生物轉化過程中分別加入不同濃度的Mn2+，各反應體系的D-果糖得率如圖4所示。當轉化體系中Mn2+濃度為10 mmol/L，D-果糖得率最高為51.43%；低于或高于該Mn2+濃度，D-果糖得率均出現(xiàn)下降趨勢。該結果說明當Mn2+濃度不足時，影響轉化效率的最大化；而當Mn2+過量時，又可能抑制ToGI酶活。因此，確定轉化體系的最佳Mn2+濃度為10 mmol/L。

圖4 轉化體系中Mn2+濃度對D-果糖得率的影響Fig.4 Effect of Mn2+concentration in the reaction mixture on the yield of D-fructose

2.2.2 確定最佳轉化溫度

溫度是影響酶促反應的重要因素之一。在一定范圍內，溫度上升增加分子的碰撞概率，從而加快反應速率；而當溫度超過某一臨界值時，酶蛋白逐漸變性使酶的反應速率降低[22]。本研究，轉化溫度對D-果糖得率的影響如圖5所示，當轉化溫度逐漸升高至95 ℃，D-果糖得率最高為54.05%；當溫度繼續(xù)升高至100 ℃，D-果糖得率急劇下降。因此，確定最佳轉化溫度為95 ℃。該轉化溫度與ToGI的最適反應溫度相同。諾維信商業(yè)化酶Sweetzyme? T在反應溫度為80 ℃時，因不耐高溫導致生產強度嚴重下降[18]。相比商業(yè)酶，ToGI更具備高溫催化的能力。

圖5 轉化溫度對D-果糖得率的影響Fig.5 Effect of conversion temperature on the yield of D-fructose

2.2.3 確定最佳轉化pH

環(huán)境pH影響酶的極性基團解離狀態(tài)，導致其所帶電荷的種類和數(shù)量不同，進而影響催化性能[23]。為了使酶的活性基團處于最佳解離狀態(tài)，考察轉化體系pH對D-果糖得率的影響,結果見圖6。之前性質研究表明，ToGI在pH 6.5～9.5時具有較高的催化活性[12]。對于轉化反應，當轉化pH為6.0，D-果糖得率僅為25.57%；當轉化pH為6.5～8.5時，D-果糖得率均維持在50%以上，其中pH 7.5時，D-果糖得率最高可達57.36%，因此，確定轉化體系的最佳轉化pH為7.5。GI在弱酸性(pH 6.5)條件下進行異構化反應會減少副產物的形成[24]。但在該條件下，多數(shù)GI活力略低[25]，例如S.murinusGI[26]和T.fuscaGI[27]等。ToGI重組菌在pH 6.5時的D-果糖轉化率仍然較高，進一步說明其在廣泛pH條件下具有更為良好的催化特性。

圖6 轉化pH對D-果糖得率的影響Fig.6 Effect of conversion pH on the yield of D-fructose

2.2.4 確定最佳底物濃度

在酶催化反應中，適當提高底物濃度可以加快反應速率，并促進產物生成[28]。例如，劉宇鵬等利用Gluconobacterkondonii靜息細胞轉化合成L-赤蘚酮糖，確定最佳底物濃度為100 g/L，再高的底物濃度會抑制細胞的甘油脫氫酶活性，降低目標產物的產量[29]。對于本研究，如圖7所示，底物濃度從50增加至500 g/L，D-果糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，確定最適D-葡萄糖濃度為200 g/L為宜；500 g/L的底物濃度會抑制酶活，導致產物轉化率為57.41%。據(jù)報道，采用80 ℃和450 g/L底物的轉化條件，ThermotoganeapolitanaGI突變體(V185T/L282P/F186S)和杜邦(原杰能科)商業(yè)酶GensweetTM的轉化率僅為32%和28%[30]，相比之下，在50～500 g/L的底物濃度范圍內，耐高溫ToGI的產物得率均在55%以上，說明其均有優(yōu)良的底物耐受力。

圖7 底物濃度對D-果糖得率的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on the yield of D-fructose

2.2.5 確定最佳催化劑量

催化劑用量影響產品的得率和生產成本[31]，需要對其進行優(yōu)化。例如：田靈芝等考察重組菌菌體濃度對-氨基丁酸合成的影響，發(fā)現(xiàn)當菌體濃度為15 g/L時，完全轉化50 g/L底物時僅需要1.5 h，考慮到經(jīng)濟成本和產物的提取方便，確定最佳菌體濃度為15 g/L[32]。ToGI濕菌體濃度對D-果糖得率的影響見圖8。催化時，菌體濃度從10增加至20 g/L，D-果糖得率逐漸升高至最大值58.3%；此時菌體量與底物相對飽和，繼續(xù)添加菌體，不能改變反應原有的平衡，轉化率反而下降。據(jù)此，確定反應的最佳濕菌體濃度為20 g/L。此結果與朱益波等利用重組菌合成苯基乳酸得到的結果具有相同的趨勢，其結果顯示當菌體干重為20 g/L時，苯基乳酸的含量最高，低于或高于此菌體干重，苯基乳酸的含量均下降[33]。

圖8 菌體濃度對D-果糖得率的影響Fig.8 Effect of wet cell concentration on the yield of D-fructose

2.3小規(guī)模轉化體系研究

按最優(yōu)的轉化條件(200 g/L底物)，將反應體系擴大至100 mL，考察重組菌生物轉化7 h內的D-果糖得率和D-葡萄糖剩余率，結果見圖9。當反應2 h，D-葡萄糖剩余率為39.95%，D-果糖得率已達56.85%。反應2～4 h時，D-果糖得率緩慢增加，隨后反應基本趨于平衡，D-果糖得率最高為57.34%。反應中發(fā)現(xiàn)有棕黃色副產物生成，推測可能是甘露糖、阿洛酮糖和其他化合物等[34]。與10 mL轉化體系相比，大體系的D-果糖得率偏小，原因可能是擴大反應體系使體系內的溶氧量增加，GI可能發(fā)生氧化反應而導致活力損失。因此，可在后續(xù)實驗中添加偏亞硫酸氫鹽等物質以維持高酶活和高轉化率[35]。

圖9 ToGI催化D-葡萄糖異構化為D-果糖Fig.9 Isomerization of D-glucose to D-fructose using ToGI

通過上述研究，應用ToGI的E.coli的重組工程菌，可以一步法生產55%以上果糖濃度的高果糖漿，技術革新，大大簡化了現(xiàn)有的后處理工藝。但在催化過程中，E.coli可能會將不符合食品衛(wèi)生要求的有害物質帶入產品中，在后續(xù)研究中，還需要將ToGI導入背景清晰的食品級表達系統(tǒng)，以實現(xiàn)高果糖漿的高效、安全生產?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)就是符合食品安全的表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有很強的蛋白質分泌功能、表達產物不容易形成包涵體、發(fā)酵條件簡單、產物易于分離純化等特點[36]。鄧輝等將來源于T.fusca的GI基因克隆在載體pMA09上，并轉化至B.subtilisWB600中，在最佳產酶條件下，GI的產量為5.6 U/mL[37]。相信隨著各環(huán)節(jié)的技術升級，一定能夠研發(fā)出具有自主知識產權、符合食品安全的耐高溫GI，切實提升現(xiàn)有的HFCS生產工藝。

3 結論

本研究詳細研究了重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI發(fā)酵產酶與生物轉化的關鍵因素。利用LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵，確定誘導溫度28 ℃、IPTG濃度0.1 mmol/L、添加5 mmol/L Mn2+時，細胞具有最高酶活231.02 U/g。運用最優(yōu)轉化體系，即10 mmol/L Mn2+、200 g/L底物和20 g/L生物催化劑，于95 ℃和pH 7.5條件下進行生物轉化，D-果糖得率高達58.3%。擴大體系D-果糖得率仍維持在55%以上。以上研究說明ToGI滿足一步法生產HFCS-55的要求，為進一步開展該酶在食品安全的表達系統(tǒng)中的表達與應用奠定基礎。

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Researchonfermentationandconversionconditionsofrecombinantstrainharboringthermophilicglucoseisomerase

JIA Dong-xu1, ZHOU Lin1, WANG Teng1, YU Chun-an1, LIAO Cheng-jun2, CHEN De-shui2, WANG Hong-yan2, LIAO Xiao-ying2, JIN Li-qun1*

1 (Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China) 2 (Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co., Ltd., Kaihua 324032, China)

Thermophilic glucose isomerase (GI) can catalyze conversion ofD-glucose toD-fructose at elevated temperature. The obtained high fructose corn syrup served as sweetener, is widely used in various food fields. Herein the fermentation and conversion conditions ofE.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI were studied. The results showed that the optimum fermentation should be performed at 28 ℃ by adding 0.1mmol/L Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and 5 mmol/L Mn2+. Then, the amplified biotransformation reaction was conducted at the condition of 20 g/L wet cell, 10 mmol/L Mn2+, 200 g/LD-glucose and pH 7.5. After bioconversion at 95 ℃ for 4 h, the yield ofD-fructose reached 57.34%. One-step production process of F55 high fructose corn syrup (HFCS) using this craft has the advantage of simplifying the subsequent step of enrichingD-fructose, and it provided an important reference for industrial application of HFCS production using food safety expression system.

Thermus oshimai glucose isomerase; engineering bacteriaE.coliBL21 (DE3)/pET28b/ToGI;D-glucose;D-fructose; biotransformation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013871

博士，副教授(金利群副教授為通訊作者,E-mail:jlq@zjut.edu.cn)。

國家自然科學青年基金(31401527)；中國博士后科學基金面上資助項目(2015M580522)；浙江省博士后擇優(yōu)項目(BSH1502149)；浙江省教育廳項目(Y201431321)；浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室開放課題(20170107)

2017-01-17，改回日期：2017-03-30