骨碎補總黃酮對高原RA繼發(fā)OP患者血清MMP-3、CD200及IL-17的作用研究

陳楷鳴，陳慧，王彩燕，劉軍*

(1.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院手術麻醉科，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心關節(jié)外科，甘肅 蘭州 730050)

實驗研究

骨碎補總黃酮對高原RA繼發(fā)OP患者血清MMP-3、CD200及IL-17的作用研究

陳楷鳴1，陳慧2，王彩燕1，劉軍2*

(1.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院手術麻醉科，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心關節(jié)外科，甘肅 蘭州 730050)

目的 研究骨碎補總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)對高原類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)繼發(fā)骨質疏松(osteoporosis，OP)患者血清基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、CD200、白介素-17(interleukin-17，IL-17)的影響。方法 選取我院2012年6月至2016年6月收治的38例高原RA繼發(fā)OP患者為研究對象，選取38例單純高原RA患者做為對照組，研究組給予骨碎補總黃酮膠囊(每粒含骨碎補總黃酮180 mg，2粒/次，3/日，8周)治療，組內(nèi)所有患者均于治療前和治療后同一天抽取靜脈血，采用蛋白印跡法(Western blotting)檢測MMP-3、CD200和IL-17表達變化，以探尋高原RA繼發(fā)OP的分子機制，為臨床治療提供參考依據(jù)。結果 與正常對照組比較，骨碎補總黃酮組治療前患者血清MMP-3、IL-17表達升高(P<0.05)，CD200表達降低(P<0.05)；經(jīng)骨碎補總黃酮治療后，骨碎補總黃酮組患者血清MMP-3、IL-17表達降低(P<0.05)，CD200表達升高(P<0.05)。結論 在高原RA繼發(fā)OP患者發(fā)病中MMP-3、CD200及IL-17可能起到重要作用，細胞因子直接或間接影響機體免疫功能和炎癥反應，骨碎補總黃酮能有效抑制上述因子的不良作用。

骨碎補總黃酮；類風濕關節(jié)炎；骨質疏松；基質金屬蛋白酶-3；CD200；白介素-17

目前研究發(fā)現(xiàn)，高原和低氧條件均影響和調節(jié)骨的生長代謝水平，有學者報道，高原低氧環(huán)境下，人體的骨折修復愈合困難，骨密度較平原下降，且易導致骨質疏松(osteoporosis，OP)等慢性骨損傷的發(fā)生[1]。在成骨和破骨作用的動態(tài)平衡中，高原低氧可促進破骨過程，抑制成骨作用。在低氧條件下培養(yǎng)成骨細胞發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)基因發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)表達在48 h降低35%，在96 h降低45%，此現(xiàn)象可能和骨生長中的關鍵因子β轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、BMP及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達均受到不同程度抑制相關[2]。單因素和logistic多元回歸分析顯示，高原地區(qū)的低氧分壓、寒冷及高原人群負重活動時間相對較少，是導致骨質疏松發(fā)生率較高的危險因素。類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種對人體多關節(jié)具有侵襲性的自身免疫性疾病。隨著疾病的不斷進展，由小關節(jié)病變、手指“天鵝頸”、“紐扣樣”改變到累及心肺及神經(jīng)系統(tǒng)受累，RA的發(fā)展和骨破壞、骨質疏松呈正相關。為探討高原RA繼發(fā)OP病因，我們對其與基質金屬蛋白酶-3(metalloproteinase，MMP-3)、白細胞介素-17(interleukin，IL-17)及CD200的相關性加以研究，探尋各指標在疾患中的作用及骨碎補總黃酮對各指標的影響，以期提供臨床治療經(jīng)驗及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究組 收集2012年6月至2016年6月期間在蘭州軍區(qū)總醫(yī)院住院的類風濕關節(jié)炎繼發(fā)骨質疏松患者38例，全部在海拔2000 m以上地區(qū)居住十年以上。入選標準：a)1987年美國風濕病學會的分類標準；b)2009年美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯(lián)盟制訂的新RA分類標準和評分系統(tǒng)；c)近三個月內(nèi)未服用過任何免疫調節(jié)劑、激素等進行治療；d)治療前雙能X線吸收測定法檢測腰椎及髖關節(jié)骨密度為：T-Score<-2.5～-1.5，平均為T-Score<-2.0。排除標準：RA晚期需行人工關節(jié)置換患者、惡性腫瘤、嚴重感染性疾病、四肢肌力小于Ⅱ級、高血壓極高危組患者。其中男12例，女26例，年齡41.5～66.5歲。研究組在抗RA治療基礎上給予骨碎補總黃酮膠囊(每粒含骨碎補總黃酮180 mg，2粒/次，3/日)，治療持續(xù)時間為8周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，在告知所有研究參與人員或法定委托人本研究的目的及意義后，均同意并簽署治療知情同意書后方可進入本研究階段。

1.1.2 對照組 選取38例高原RA患者，納入標準第4條修正為：患者治療前雙能X線吸收測定法檢測腰椎及髖關節(jié)骨密度為：T-Score>-1；排除標準同上。其中男10例，女28例，年齡42.0～65.0歲，同意并簽署治療知情同意書。對照組患者給予常規(guī)抗RA治療。兩組在性別、年齡、身高、體質量、病情等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 骨碎補總黃酮組和對照組治療前后均于同一天上午6時一次采集外周靜脈血5 mL，置于肝素抗凝管中，按3 000 r/min低溫離心10 min后取血清放置于-70℃冰箱貯存。

1.2.2 檢測方法 Western blotting法測定血清中MMP-3、CD200及IL-17含量表達水平，取定量樣品，SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，封閉，洗膜，加入1︰600稀釋的MMP-3、CD200及IL-17一抗，4℃下過夜存放，用洗膜液漂洗后加入1︰1 000稀釋的二抗，搖床1 h，TBST(tris buffered saline tween)沖洗3遍，每次5 min，加電化學發(fā)光法(electric chemi lumine scence，ECL)熒光液顯色，上機檢測。用目標條帶與內(nèi)標條帶(β-actin)的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)比值的百分率表示MMP-3、CD200和IL-17的表達水平。

2 結 果

2.1 骨碎補總黃酮治療前后，高原RA繼發(fā)OP患者MMP-3表達水平比較 與對照組(0.65±0.05)相比，高原RA繼發(fā)OP患者治療前MMP-3為(1.26±0.08)，表達增高(P<0.05)；骨碎補總黃酮治療后，患者MMP-3為(0.76±0.07)，表達降低(P<0.05)；且骨碎補總黃酮治療前后之間比較，患者MMP-3表達降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 骨碎補總黃酮治療前后MMP-3蛋白表達水平變化

2.2 骨碎補總黃酮治療前后，高原RA繼發(fā)OP患者CD200表達水平比較 與對照組(0.95±0.07)相比，骨碎補總黃酮治療前，高原RA繼發(fā)OP患者CD200為(0.51±0.04)，表達降低(P<0.05)，骨碎補總黃酮治療后，患者CD200為(0.83±0.06)，表達升高(P<0.05)，且骨碎補總黃酮治療前后比較，患者CD200表達水平增高(P<0.05)。見圖2。

圖2 骨碎補總黃酮治療前后CD200蛋白表達水平變化

2.3 骨碎補總黃酮治療前后，高原RA繼發(fā)OP患者IL-17表達水平比較 與對照組(0.71±0.05)相比，骨碎補總黃酮治療前，高原RA繼發(fā)OP患者IL-17為(1.50±0.09)，表達增高(P<0.05)，骨碎補總黃酮治療后，患者IL-17為(1.08±0.08)，表達降低(P<0.05)，且骨碎補總黃酮治療前后之間比較，患者IL-17表達水平降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 骨碎補總黃酮治療前后IL-17水平表達水平變化

3 討 論

高原低氧環(huán)境下可使機體免疫應答能力升高，增加炎性因子的表達水平。Arnett及Knowles等[3-4]學者通過不同研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子1ɑ可通過血管生成素樣蛋白-4間接激活破骨細胞的生成，高表達的破骨細胞進而發(fā)揮刺激骨吸收的作用。Utting和Knowles等[5-6]均證實低氧環(huán)境可促進線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，通過線粒體功能障礙，使巨核細胞分化為破骨細胞數(shù)量增加。郗焜及陳亮等[7-8]報道海拔較高環(huán)境下老年男性久居人群的血清骨代謝生化指標、脂肪細胞因子Chemerin等指標會相應發(fā)生不同程度的變化，低氧環(huán)境在其中發(fā)揮重要影響。杜珊珊等[9]報道降鈣素可通過作用于CD36及IL-17等生物因子發(fā)揮抗高原骨質疏松的作用，其機制可能和調節(jié)機體免疫系統(tǒng)相關。李得春等[10]研究表明青海高原地區(qū)老年婦女OP患者骨密度水平顯著性低于對照組，這一結果提示高原地區(qū)的缺氧環(huán)境可能誘發(fā)骨質疏松的發(fā)生，患者血清中低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1ɑ、HIF-2ɑ及VEGF和骨代謝過程存在密切聯(lián)系。長期RA病史的患者往往伴隨骨質疏松，表現(xiàn)為全身骨量明顯減少，骨組織顯微結構發(fā)生改變，例如骨小梁變細、骨皮質變薄、骨脆性明顯增高等。RA進展至晚期時可導致軟骨、骨(皮質骨/松質骨)、肌腱、韌帶和血管等多個組織的破壞，通過影響骨代謝過程而導致骨密度降低。因而，較之一般RA患者，高原低氧環(huán)境下久居的RA患者常伴隨嚴重的OP問題。骨碎補總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)作為傳統(tǒng)的提高堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，Col Ⅰ)及骨鈣素(bone gla protein，BGP)的中藥，副作用小、經(jīng)濟、安全，在治療OP領域具有極大潛力。

MMPs是一組降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要酶系，在炎癥反應、自身免疫性疾病、惡性腫瘤浸潤及心腦血管疾病等多個過程發(fā)揮作用，其中MMP-3屬于基質金屬蛋白酶中的明膠酶型。在動物模型中利用三點彎曲和壓縮試驗測定骨組織的模量和硬度發(fā)現(xiàn)，在明膠酶型基質金屬蛋白酶高表達情況下，實驗小鼠的骨質密度及強度均低于野生小鼠。有研究證實在婦女絕經(jīng)后發(fā)生的OP過程中，血清骨保護素濃度和同屬明膠酶型的MMP-2表達的增強可能是骨質疏松高轉換狀態(tài)的標志。本研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，高原RA繼發(fā)OP患者MMP-3表達增高(P<0.05)，經(jīng)骨碎補總黃酮治療后的患者MMP-3表達降低(P<0.05)。提示高原RA繼發(fā)OP患者的MMP-3含量發(fā)生明顯改變，可能和下列因素相關：a)MMP-3可逐漸降解覆蓋于骨組織表面的Ⅰ型膠原屏障，誘使破骨細胞與礦化骨基質直接接觸，啟動骨吸收過程；b)MMP-3通過影響炎癥因子、化學因子及非蛋白水解功能，影響骨代謝；c)TFRD具有抑制破骨細胞生成和調控成骨增殖能力。

CD200分子質量為41-47 kDa，是一種Ⅰ型膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。CD200及其受體蛋白CD200R參與多種自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展過程，有研究顯示系統(tǒng)性紅斑狼瘡(S患者CD4+T細胞、樹突狀細胞及血清游離CD200水平高于健康對照組[11]。RA患者經(jīng)英夫利西單抗聯(lián)合甲氨碟呤治療后，隨著血沉、C反應蛋白的降低，CD200/CD200R在患者外周血單核細胞及輔助性T細胞中呈現(xiàn)高表達，其作為抗炎信號通過多種機制發(fā)揮免疫抑制作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)CD200在高原RA繼發(fā)OP患者經(jīng)TFRD治療后明顯升高(P<0.05)，其機制可能為：a)CD200通過作用機體神經(jīng)元-小神經(jīng)膠質細胞或神經(jīng)膠質細胞間的相互作用抑制免疫應答影響；b)CD200抑制免疫功能的途徑可能和調控單核-巨噬細胞、Thl7細胞及破骨細胞的形成相關；c)TFRD通過調節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸功能、改善機體免疫系統(tǒng)的紊亂狀態(tài)，發(fā)揮保護功能。

白細胞介素-17(interleukin 17，IL-17)是一種強有力的促炎因子，也是炎癥反應的微調因子，可以誘導多種促炎因子的產(chǎn)生，包括IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-ɑ(tumor necrosis factor-α，TNF-ɑ)及MMPs等[13]。對膠原誘導關節(jié)炎小鼠模型應用抗體中和內(nèi)源性IL-17的研究發(fā)現(xiàn)，動物模型的關節(jié)炎性改變降低、軟骨及骨的侵蝕破壞受到抑制。RA患者的滑膜液細胞(synovial fluid cell，SFMc)中由CD4+T淋巴細胞分泌的IL-17及TNF-ɑ的水平均較對照組升高。在本研究中，與對照組相比，骨碎補總黃酮治療前，高原RA繼發(fā)OP患者IL-17表達增高，骨碎補總黃酮治療后，高原RA繼發(fā)OP患者IL-17表達降低(P<0.05)，分析原因可能為：a)IL-17通過刺激滑膜細胞表達分泌角質細胞生長因子(keratinocyte grownl factor，KGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growtll factor，HGF)等血管因子促進血管翳的形成，通過誘導MMPs破壞蛋白多糖分子及促破骨細胞生成影響機體關節(jié)功能的骨密度[14]；b)TFRD通過影響炎癥過程進而抑制骨密度下降，提高骨礦化能力。

綜上所述，高原RA繼發(fā)OP患者中，MMP-3、CD200及IL-17通過多種作用途徑影響疾病轉歸過程，其表達水平變化具有重要意義。骨碎補總黃酮通過作用于上述因子，發(fā)揮抑制炎癥反應、增強機體免疫功能，同時可防止骨質疏松程度加重。其具體作用分子信號通路需要我們進一步研究。

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Expression and Significance of MMP-3、CD200 and IL-17 in the Plateau RA with Osteoporosis Patients after Treatment with TFRD

Chen Kaiming1，Chen Hui2，Wang Caiyan1，et al

(1.Department of Surgical Anesthesia，Lanzhou General Hospital of PLA，Lanzhou 730050，China；2.Department of Orthopaedics Center，Lanzhou General Hospital of PLA，Lanzhou 730050，China)

Objective To study the diference of the Matrix metalloproteinase-3(MMP-3)，CD200 and Interleukin-17 levels of the patients with plateau RA with osteoporosis patients before and after treatment with TFRD.Methods Tests on 38 patients before and after treatment with TFRD in RA with osteoporosis patients，the control group by administering TFRD (1 080 mg/d；after 8 week)，all patients before treatment and after treatment for venous blood，using MMP-3，CD200 and IL-17 to detect the Western expression of blot.Results Compared with the control group，the MMP-3，IL-17 expression increased significantly and CD200 expression decreased in the former TFRD group of patients(P<0.05)；after treatmen with TFRD，the MMP-3，IL-17 were decreased(P<0.05)，the CD200 expression was increased significantly(P<0.05).Conclusion The MMP-3，CD200 and IL-17 may play an important role in the highlands of RA with OP patients，cytokines directly or indirectly affect immune function and inflammatory response，TFRD can effectively prevent osteoporosis patients degree of aggravation.

total flavonoids of rhizoma drynariae；rheumatoid arthritis；osteoporosis；matrix metalloproteinase-3；CD200；interleukin-17

1008-5572(2017)08-0711-04

甘肅省青年科技基金(1606RJYA300)；*本文通訊作者：劉軍陳楷鳴，陳慧，王彩燕，等.骨碎補總黃酮對高原RA繼發(fā)OP患者血清MMP-3、CD200及IL-17的作用研究[J].實用骨科雜志，2017，23(8)：711-714.

R593.21

A

2017-04-05

陳楷鳴(1982- )，女，護師，蘭州軍區(qū)總醫(yī)院手術麻醉科，730050。