動(dòng)態(tài)壓力負(fù)荷對(duì)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)及PTHrP mRNA的影響

吳曉東，張玉玲，白廣超，李寬新

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院，烏魯木齊830000)

動(dòng)態(tài)壓力負(fù)荷對(duì)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)及PTHrP mRNA的影響

吳曉東，張玉玲，白廣超，李寬新

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院，烏魯木齊830000)

目的 探討動(dòng)態(tài)壓力刺激對(duì)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)mRNA表達(dá)水平的影響。方法 采用免疫磁珠法分離培養(yǎng)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞，將細(xì)胞分為0、30、60、90 mmHg組，采用動(dòng)態(tài)壓力細(xì)胞培養(yǎng)裝置向各組分別施加0、0～30、0～60、0～90 mmHg的動(dòng)態(tài)壓力刺激。作用1、6、24 h后，采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)[包括Ⅱ型膠原、葡聚多糖(aggrecan)、Ⅹ型膠原]及PTHrP mRNA表達(dá)。結(jié)果 30、60、90 mmHg組Ⅱ型膠原均有明顯表達(dá)且在6 h時(shí)達(dá)到最高，30、60、90 mmHg組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均大于0 mmHg組(P均<0.05)；30、60、90 mmHg組aggrecan mRNA均有明顯表達(dá)且在6 h時(shí)達(dá)到最高，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)30、60、90 mmHg組的表達(dá)量均大于0 mmHg組(P<0.05)；0、30、60、90 mmHg組Ⅹ型膠原mRNA均有較低表達(dá)，且各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；30、60、90 mmHg組PTHrP mRNA均有較高表達(dá)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)30、60、90 mmHg組的表達(dá)量均大于0 mmHg組(P均<0.05)，PTHrP mRNA表達(dá)量隨著受力時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。結(jié)論 動(dòng)態(tài)壓力負(fù)荷可上調(diào)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞PTHrP mRNA表達(dá)，促進(jìn)其細(xì)胞外基質(zhì)的形成及增殖。

動(dòng)態(tài)壓力；生長(zhǎng)板；軟骨干細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)；甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白

生長(zhǎng)板是位于骨骺和干骺端之間的透明軟骨區(qū)，具有縱向和橫向生長(zhǎng)的功能，其厚度及骨的長(zhǎng)度由干骺端軟骨中各層細(xì)胞的增殖與分化情況決定。葡聚多糖(aggrecan)和Ⅱ型膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，而細(xì)胞外基質(zhì)包繞生長(zhǎng)板軟骨中的軟骨干細(xì)胞形成柱狀結(jié)構(gòu)，其肥大層軟骨細(xì)胞特異性表達(dá)Ⅹ型膠原[1]。骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育主要靠生長(zhǎng)板內(nèi)軟骨成骨，人體在運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)對(duì)生長(zhǎng)板產(chǎn)生生物力學(xué)刺激。在生長(zhǎng)發(fā)育期，這些刺激可以影響生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的功能活動(dòng)，對(duì)骨的發(fā)育與成熟十分重要[2]。生物力學(xué)刺激作用到生長(zhǎng)板時(shí)，可以引起一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)表達(dá)增加或減少[3，4]。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)的主要生理作用為調(diào)節(jié)鈣磷代謝，其對(duì)軟骨干細(xì)胞的分化亦發(fā)揮重要的作用。2015年8月～2016年6月，我們通過(guò)體外分離、培養(yǎng)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞，使用動(dòng)態(tài)壓力細(xì)胞培養(yǎng)裝置對(duì)其施加壓力刺激，觀察Ⅱ型膠原、aggrecan、Ⅹ型膠原及PTHrP mRNA表達(dá)變化，為探討動(dòng)態(tài)壓力對(duì)軟骨干細(xì)胞增殖及分化的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2周齡SD大鼠，雌雄不限，由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，雙抗(Hyclone公司)，Ⅱ型膠原酶(Invitrogen公司)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，免疫磁珠二抗(4ABio公司)，TRIzol試劑盒(Promega公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(Takara公司)，DEPC、溴化乙錠、瓊脂糖(Sigma公司)，PCR Marker Ⅰ(上海浩然生物技術(shù)有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(阿爾泰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，動(dòng)態(tài)壓力細(xì)胞培養(yǎng)裝置(自行設(shè)計(jì)制備)，光學(xué)顯微鏡(卡爾蔡司公司)，PCR儀(Eppendoff 公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio RAD公司)。

1.2 大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將大鼠用頸椎脫臼法處死，超凈臺(tái)內(nèi)分離四肢，剪下股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端軟骨，PBS漂洗。加入0.25%的胰蛋白酶消化后，再加入0.2%Ⅱ型膠原酶消化過(guò)夜；以200目篩網(wǎng)過(guò)濾，將得到的細(xì)胞進(jìn)行離心漂洗；隨后加入完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。將細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后加入胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。依次加入CD200兔多克隆抗體、免疫磁珠二抗(羊抗兔)，PBS漂洗，細(xì)胞懸浮于Buffer溶液中。向磁場(chǎng)中的分離柱內(nèi)緩慢滴加細(xì)胞懸液，撤去磁場(chǎng)后用Buffer溶液快速?zèng)_洗分離柱，洗脫下來(lái)的陽(yáng)性細(xì)胞即為生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3日換液1次；當(dāng)細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí)用胰蛋白酶消化，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 取培養(yǎng)第3代的生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞，待細(xì)胞融合至培養(yǎng)瓶底60%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所施加的壓力將細(xì)胞分為0、30、60、90 mmHg組，將培養(yǎng)瓶放入動(dòng)態(tài)壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱，連接壓力控制系統(tǒng)。通過(guò)改變進(jìn)口氣體流量調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壓力，分別給予0、0～30、0～60、0～90 mmHg的動(dòng)態(tài)壓力，加壓頻率設(shè)置為0.1 Hz，使用壓力表觀察瓶?jī)?nèi)壓力變化，分別施壓1、6、24 h。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞培養(yǎng)換液前及換液后，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、融合度。對(duì)第3代生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞施加0、0～30、0～60、0～90 mmHg動(dòng)態(tài)壓力刺激后，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 細(xì)胞Ⅱ型膠原、aggrecan、Ⅹ型膠原、PTHrP mRNA檢測(cè) 采用半定量RT-PCR方法。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，Ⅱ型膠原上游引物為5′-CACCCAGAGTGGAAGAGCG-3′，下游引物為5′-TCAGTGGACAGTAGACGGAGGA-3′；aggrecan上游引物為5′-CTTCCGCTGGTCTGATGG-3′，下游引物為5′-TAGCCTGTGCTTGTAGGTGTTG-3′；Ⅹ型膠原上游引物為5′-CAGTGCTAACCAGGGGGTAA-3′，下游引物為5′-CTCCCTGAAGCTGAACCAAG-3′；PTHrP上游引物為5′-GACTTGCCCTTGTCATGCAGT-3′，下游引物為5′-GGAGCGTCCTGGTGTTCCT-3′。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×PCR TaqMix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL，共計(jì)25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s。取PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各電泳條帶吸光灰度值，計(jì)算各組Ⅱ型膠原、aggrecan、Ⅹ型膠原、PTHrP與GAPDH灰度值的比值。

2 結(jié)果

2.1 各組生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 顯微鏡下可見(jiàn)，體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞呈三角形或多角形，具有豐富的胞質(zhì)，增殖速度較快，呈單層生長(zhǎng)。原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底約需8 d，傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)狀態(tài)良好。對(duì)第3代大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞分別施加大小為0、0～30、0～60、0～90 mmHg，持續(xù)時(shí)間為1、6、24 h的動(dòng)態(tài)壓力刺激后，光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)與未施加壓力刺激時(shí)無(wú)明顯變化。

2.2 各組不同時(shí)間Ⅱ型膠原、aggrecan、Ⅹ型膠原、PTHrP mRNA表達(dá)比較 動(dòng)態(tài)壓力刺激6 h后30、60、90 mmHg組Ⅱ型膠原、aggrecan mRNA表達(dá)達(dá)高峰，其中90 mmHg組高于30、60 mmHg組。各組不同時(shí)間點(diǎn)Ⅹ型膠原mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0、30、60、90 mmHg組PTHrP mRNA表達(dá)隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加，刺激24 h時(shí)30、60、90 mmHg組高于0 mmHg組(P均<0.05)；在1、6 h時(shí)，90 mmHg組高于0、30、60 mmHg組。見(jiàn)表1～4。

表1 各組不同時(shí)間Ⅱ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與同時(shí)點(diǎn)0 mmHg組比較，*P<0.05；與同組1 h時(shí)比較，#P<0.05。

表2 各組不同時(shí)間aggrecan mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與同時(shí)點(diǎn)0 mmHg組比較，*P<0.05；與同組1 h時(shí)比較，#P<0.05。

表3 各組不同時(shí)間Ⅹ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量比較±s)

表4 各組不同時(shí)間PTHrP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與同時(shí)點(diǎn)0 mmHg組比較，*P<0.05；與同組1 h時(shí)比較，#P<0.05。

3 討論

骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育主要靠生長(zhǎng)板內(nèi)軟骨成骨，人體在運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)對(duì)生長(zhǎng)板產(chǎn)生生物力學(xué)刺激，在生長(zhǎng)發(fā)育期，這些刺激可影響生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的功能活動(dòng)，引起一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)表達(dá)量的增加或減少[5]。Ⅱ型膠原和aggrecan作為生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是維持生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞正常生理功能的關(guān)鍵物質(zhì)，而Ⅹ型膠原是肥大層軟骨干細(xì)胞特異性表達(dá)合成的膠原[6]。細(xì)胞表型分化及功能狀態(tài)可通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)情況來(lái)反映，研究表明，壓力刺激可影響aggrecan、Ⅱ型和Ⅹ型膠原表達(dá)[7]。Bries等[8]對(duì)生長(zhǎng)板施以靜態(tài)壓力，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組Ⅱ型和Ⅹ型膠原表達(dá)較對(duì)照組降低；Kaviani等[9]對(duì)生長(zhǎng)板施加應(yīng)力干預(yù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的增殖活性及細(xì)胞基質(zhì)的合成較對(duì)照組升高；Sergerie等[10]對(duì)生長(zhǎng)板分別給予靜態(tài)壓力和動(dòng)態(tài)壓力刺激，發(fā)現(xiàn)靜態(tài)壓力組Ⅱ型膠原、aggrecan表達(dá)減少，動(dòng)態(tài)壓力組Ⅱ型膠原、aggrecan表達(dá)增加。本研究中，對(duì)培養(yǎng)至第3代的大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞分別施加大小為0、30、60、90 mmHg的壓力刺激，發(fā)現(xiàn)持續(xù)1、6、24 h時(shí)0、0～30、0～60、0～90 mmHg組細(xì)胞在形態(tài)上并無(wú)明顯差異，表明動(dòng)態(tài)壓力刺激對(duì)大鼠生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的形態(tài)變化影響較小。

Ⅱ型膠原和aggrecan作為生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞得以正常生存、分化和發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)[11]，適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳び欣谏L(zhǎng)板機(jī)械及功能結(jié)構(gòu)的形成。生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞在分化過(guò)程中Ⅹ型膠原的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化[12]，故Ⅹ型膠原可作為監(jiān)測(cè)軟骨內(nèi)骨化過(guò)程的可靠指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)壓力刺激6 h后30、60、90 mmHg組Ⅱ型膠原、aggrecan mRNA表達(dá)均達(dá)高峰，且90 mmHg組高于30、60 mmHg組，提示動(dòng)態(tài)壓力刺激可明顯增加外基質(zhì)中aggrecan及Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)；但本研究中30、60、90 mmHg組Ⅹ型膠原mRNA表達(dá)量與0 mmHg組比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其在生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的分化過(guò)程中起到的作用可能不明顯。

PTHrP的主要作用為調(diào)節(jié)鈣磷代謝，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程中具有重要作用[13]。PTHrP在骨骼中主要是由生長(zhǎng)板周?chē)浌悄ぶ械纳L(zhǎng)板干細(xì)胞合成，以自分泌和旁分泌的形式調(diào)控自身及周?chē)浌羌?xì)胞的鈣磷代謝，在時(shí)間和空間上協(xié)調(diào)生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞的分化[14]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)動(dòng)態(tài)壓力刺激作用到生長(zhǎng)板上時(shí)，某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制會(huì)被激活，引起PTHrP表達(dá)量增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成及細(xì)胞增殖[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，刺激24 h時(shí)30、60、90 mmHg組PTHrP mRNA表達(dá)高于0 mmHg組，在1、6 h時(shí)90 mmHg組PTHrP mRNA表達(dá)高于0、30、60 mmHg組，提示動(dòng)態(tài)壓力刺激可明顯增加外基質(zhì)中PTHrP mRNA的表達(dá)。

綜上所述，對(duì)生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞施加動(dòng)態(tài)壓力刺激后，PTHrP、Ⅱ型膠原和aggrecan mRNA表達(dá)均上調(diào)。表明適當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)壓力可以通過(guò)某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)上調(diào)PTHrP mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨干細(xì)胞外基質(zhì)的形成及增殖，其具體調(diào)節(jié)通路仍需進(jìn)一步研究。

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新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(wsj201406)。

李寬新(E-mail: likuanxin@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.011

Q954.65

A

1002-266X(2017)30-0040-03

2016-12-09)