親水作用色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定原料乳和液體乳中三聚氰胺和舒巴坦

薛 霞,鄭 紅,魏莉莉,劉艷明,祝建華,王 駿

(山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南 250101)

薛 霞,鄭 紅,魏莉莉,劉艷明,祝建華,王 駿*

(山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南 250101)

建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定原料乳和液體乳中三聚氰胺和舒巴坦的分析方法。試樣采用2%乙酸水溶液提取,經(jīng)乙腈沉淀蛋白,以乙腈-乙酸銨溶液為流動相,經(jīng)Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱分離后,采用多反應監(jiān)測(MRM)掃描,外標法定量。三聚氰胺定量下限為10 μg/kg,加標回收率為85.4%～102.5%,相對標準偏差為3.10%～6.55%。舒巴坦檢定量下限為1.0 μg/kg,加標回收率為86.1%～104.3%,相對標準偏差為2.35%～5.37%。該方法前處理簡便快捷,靈敏度高,回收率和重現(xiàn)性良好,適用于原料乳和液體乳中三聚氰胺和舒巴坦的測定。

三聚氰胺,舒巴坦,親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,原料乳,液體乳

乳制品是人們生活中重要的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源之一,素有“一杯奶強壯一個民族”的說法。在過去十年內(nèi),我國乳品工業(yè)發(fā)生了一系列的安全問題和風波,對乳品工業(yè)的發(fā)展造成了深遠的影響。其中最為嚴重的是2008年發(fā)生的“三聚氰胺”事件,不法分子為謀取暴利,在原料奶中添加三聚氰胺使蛋白質(zhì)測定值虛高。在畜牧養(yǎng)殖環(huán)節(jié),濫用抗生素已經(jīng)成為乳品行業(yè)的一大隱患,其中β-內(nèi)酰胺類抗生素是應用最廣泛的一類藥物,俗稱解抗劑的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)由于具有降解抗生素的作用,一度被列入非法添加物的范疇。隨著監(jiān)管力度的加大,能夠?qū)功?內(nèi)酰胺酶檢測的舒巴坦浮出水面,使得乳品監(jiān)管領域的風險愈加突出。

三聚氰胺和舒巴坦作為當前乳品監(jiān)管中的重點檢測對象,也是乳品企業(yè)在原料乳驗收和液體乳出廠檢驗重點控制的指標,各級檢驗機構和乳品企業(yè)都高度關注。報道的三聚氰胺的檢測方法主要有液相色譜法[1-4]、液質(zhì)聯(lián)用法[1,5-7]、氣質(zhì)聯(lián)用法[1,8-9]、酶聯(lián)免疫法[10]等,測定原料乳中的三聚氰胺大多需經(jīng)過固相萃取凈化,操作步驟繁瑣,前處理時間長。GB/T 22400-2008[11]只針對原料奶和不含添加物的液態(tài)奶,采用乙腈作為樣品的蛋白沉淀劑和三聚氰胺提取劑,磷酸鹽為流動相,強陽離子交換色譜柱進行液相色譜分離測定。含有磷酸鹽的流動相易造成液相色譜單向閥堵塞及其他部件的磨損,且不能和質(zhì)譜兼容。舒巴坦至今未發(fā)布國家標準?，F(xiàn)有測定舒巴坦的方法包括高效液相色譜法[12-13]、液-質(zhì)聯(lián)用法[14-17]、分光光度法[18-19]等。在原料乳驗收和液體乳監(jiān)管中,三聚氰胺和舒巴坦均需檢驗,而現(xiàn)有檢測方法需要進行兩次檢驗才能完成,未見同時測定的報道。本研究采用親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術同時測定原料乳和液體乳中三聚氰胺和舒巴坦,適用于大批量樣品的快速檢測。

表1 三聚氰胺和舒巴坦的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of melamine and sulbactam

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三聚氰胺標準物質(zhì)(純度≥97.0%)、舒巴坦標準物質(zhì)(純度≥99.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、乙酸銨(色譜純);冰乙酸(優(yōu)級純);超純水 Mili-Q超純水機制備;色譜柱 Acquity UPLC BEH HILIC(100 mm×2.1 mm i. D.,1.7 μm),美國Waters公司;巴氏殺菌乳、滅菌乳和調(diào)制乳 市售,100余批次。

Acquity UPLC(I-CLASS)超高效液相色譜、XEVO TQ-S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜 配有電噴霧(ESI)電離源,美國Waters公司;MS204S型電子天平 瑞士梅特勒公司;SECURA2102-1CN/SQP型電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;MS3型漩渦混合器 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備溶液制備 三聚氰胺標準儲備溶液:準確稱取10 mg(精確到0.01 mg)三聚氰胺標準品于10 mL 容量瓶中,1∶1的甲醇-水溶液為溶劑進行溶解并定容至刻度,配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液,于4 ℃避光保存。

舒巴坦標準儲備液:準確稱取10 mg(精確到0.01 mg)舒巴坦標準品于10 mL容量瓶中,用超純水溶解并定容至刻度,配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液,于4 ℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理方法 準確稱取5.0 g(精確到0.01 g)試樣于25 mL比色管中,加入15 mL 2%乙酸溶液,超聲提取20 min,取出恢復至室溫后,用2%乙酸定容至刻度,漩渦混合2 min。

準確移取2.0 mL提取液至10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,充分混勻后靜置5 min,經(jīng)0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后上機測定。

1.2.3 標準系列工作溶液 稱取5份相同的空白基質(zhì),按照1.2.2的步驟制備空白基質(zhì)提取液,加入不同體積的三聚氰胺和舒巴坦標準溶液,制備系列標準工作溶液,使三聚氰胺的濃度分別為:0.02、0.1、1、5、20 ng/mL,舒巴坦的濃度分別為0.05、0.5、5、25、100 ng/mL。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱:Acquity UPLC BEH HILIC 100 mm×2.1 mm i. d.,粒徑1.7 μm;流動相:10 mmol/L乙酸銨溶液(A)、乙腈(B),梯度條件:0～4.0 min:5% A線性增至15% A,4.5 min:線性增至40% A,保持至5.5 min,5.6 min:5% A;流速0.35 mL/min;柱溫:40 ℃,進樣體積:2 μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源;掃描方式:多反應監(jiān)測;電離電壓:2.5 kV;離子源溫度:150 ℃;霧化溫度:450 ℃;錐孔氣流速:50 L/h;霧化氣流速:800 L/h;碰撞室壓力:3.5×10-3mPa;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的確定

本文采用了Waters公司ACQUITY UPLCTMBEH HILIC色譜柱進行分離,以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相,進行梯度洗脫,獲得的分離度、峰形和靈敏度俱佳,最終決定采用該體系分離測定三聚氰胺和舒巴坦,其標準溶液的質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖1 三聚氰胺和舒巴坦標準溶液的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixture of melamine and sulbactam standard solution in MRM mode注:a-舒巴坦;b-三聚氰胺。圖2～圖4同。

三聚氰胺和舒巴坦均屬于極性化合物,在反相色譜柱上幾乎沒有保留,死時間附近出峰,難以定性和定量測定。我們先后比較了三聚氰胺和舒巴坦在BEH C18、Atlantis T3、SB C18和BEH HILIC四種色譜柱上的保留行為,結果發(fā)現(xiàn)只有BEH HILIC保留適中,最終我們選擇采用BEH HILIC進行目標物的分離。親水作用色譜柱使用高比例水溶性有機相的流動相,有利于提高質(zhì)譜的離子化效率,從而提高質(zhì)譜分析的靈敏度[20]。

從目標物結構分析,三聚氰胺適合采用正離子模式采集,而舒巴坦適合采用負離子模式采集。將濃度為1.0 mg/L的三聚氰胺和舒巴坦標準溶液,分別通過蠕動泵注入質(zhì)譜儀,調(diào)諧并優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù),最終確定三聚氰胺和舒巴坦的定性離子對和定量離子對見表1。

表2 兩種方法檢測結果比較Table 2 Comparison of two methods of testing results

2.2 樣品前處理條件的選擇

三聚氰胺具有弱堿性,采用酸性提取劑有利于增加提取效率。舒巴坦易溶于水,以水溶液作提取劑可獲得較好的提取效率。原料乳和液體乳的基質(zhì)基本相同,均含有蛋白、脂肪、乳糖等多種干擾成分,若不去除將嚴重干擾測定,且容易對色譜柱造成污染。綜合上述幾點,我們采用了2%乙酸水溶液作為提取溶劑,進行提取,然后用乙腈稀釋5倍的方式來處理樣品。加入乙腈后蛋白沉淀充分,濾液澄清。80%乙腈的存在,有利于乳糖的析出。乙酸屬于揮發(fā)性酸,與質(zhì)譜兼容性好。

對三聚氰胺的檢測,GB/T22388-2008[1]第一法和第二法采用三氯乙酸-乙腈提取,陽離子交換柱凈化后,用高效液相色譜或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測,前處理時間較長。液體乳中舒巴坦的檢測文獻[14-15,17]也需要采用固相萃取柱凈化。本文研究了免固相萃取的快速前處理方法,前處理時間比固相萃取凈化的方法縮短了2/3,僅需15 min,靈敏度不低于固相萃取凈化的方法。我們在原料乳和液體乳中分別添加三聚氰胺和舒巴坦標準溶液作為陽性樣品,然后采用兩種方法分別進行測定,測定結果見表2。從表2可以看出,兩種檢驗方法定量結果無差異,可滿足檢測的要求。

分別采用試劑和空白基質(zhì)溶液稀釋相同濃度標準溶液的辦法考察基質(zhì)對目標物的影響。上機測定發(fā)現(xiàn),與試劑稀釋的標準溶液相比,基質(zhì)稀釋的標準溶液中三聚氰胺響應值低30%～40%,舒巴坦低15%～20%,原料乳和液體乳基質(zhì)沒有差異。因此,本方法對原料乳和液體乳采用相同的方法處理,并采用基質(zhì)空白提取液稀釋標準溶液,外標法定量。

2.3 線性范圍

將1.2.3配制的標準工作溶液按濃度從低到高依次經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定,以定量離子對的色譜峰面積y為縱坐標,以標準工作溶液濃度值(ng/mL)x為橫坐標,繪制標準曲線,分別獲得三聚氰胺和舒巴坦的線性回歸方程(如表3所示)。由表3可見,在0.02～20 ng/mL范圍內(nèi),三聚氰胺的濃度與峰面積呈良好的線性關系,相關系數(shù)R2為0.997;在0.05～100 ng/mL范圍內(nèi),舒巴坦的濃度與峰面積呈良好的線性關系,相關系數(shù)R2為0.999。待測試樣中三聚氰胺和舒巴坦響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi),超過線性范圍則應稀釋后再進行分析。

表3 三聚氰胺和舒巴坦的線性方程和相關系數(shù)Table 3 Linear equations,correlation coefficients of melamine and sulbactam

2.4 方法回收率和精密度

采用生牛乳和液體乳(滅菌乳、調(diào)制乳)空白樣品,進行添加回收率和精密度實驗。空白樣品中分別加入低、中、高三個濃度水平的標準溶液,按照步驟1.2進行檢測,每個添加量平行測定6次。同時采用空白基質(zhì)匹配的標準溶液進行回收率和相對標準偏差計算,結果見表4。由表4可見,三聚氰胺回收率在85.4%～102.5%范圍內(nèi);舒巴坦回收率在86.1%～104.3%范圍內(nèi)。對不同試樣重復測定6次,測定結果均具有良好的重現(xiàn)性,三聚氰胺和舒巴坦的RSD分別為3.10%～6.55%和2.35%～5.37%。

表4 三聚氰胺和舒巴坦加標回收率和精密度(n=6)Table 4 Recovery and RSD for the determination of melamine and sulbactam(n=6)

圖2 空白滅菌乳中三聚氰胺和舒巴坦的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of melamine and sulbactam in bank milk

圖3 空白滅菌乳中三聚氰胺和舒巴坦定量限水平的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.3 MRM chromatogram showing the LOQs for melamine and sulbactam

圖4 空白滅菌乳中三聚氰胺和舒巴坦加標樣品多反應監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of a blank milk spiled with melamine and sulbactam

采用空白樣品加標法,以信噪比RSN≥3確定檢出限(LOD),信噪比RSN≥10為定量限(LOQ)。三聚氰胺的檢出限為3 μg/kg,定量限為10 μg/kg;舒巴坦的檢出限為0.3 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg。滅菌乳中三聚氰胺和舒巴坦的空白、定量限及高水平加標樣品(三聚氰胺150 μg/kg,舒巴坦100 μg/kg)譜圖如圖2～圖4所示。

2.5 實際樣品檢測

應用本方法對市售的巴氏殺菌乳、滅菌乳及調(diào)制乳等樣品100余批次進行了檢測,三聚氰胺有2批次檢出,檢出值為0.02～0.03 mg/kg,舒巴坦有1批次檢出,檢出值為1.2 μg/kg。由檢測結果可見,三聚氰胺含量水平遠低于國家規(guī)定的限量要求,應不屬于人為添加。舒巴坦檢出值雖然比較低,但仍有添加舒巴坦掩蔽β-內(nèi)酰胺酶的可能性。

3 結論

本文建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定液體乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速檢測方法。該方法采用親水作用色譜使分離效果大幅改善,與質(zhì)譜聯(lián)用靈敏度顯著提高,且不需固相萃取凈化,全部前處理可在15 min內(nèi)完成,測定回收率、精密度和靈敏度均可滿足各類檢測要求。本方法檢測速度快,檢驗成本低,特別適合乳品企業(yè)和檢驗機構批量化檢驗工作的開展。

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Determination of melamine and sulbactam in raw milk and liquid milk by hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry

XUE Xia,ZHENG Hong,WEI Li-li,LIU Yan-ming,ZHU Jian-hua,WANG Jun*

(Shandong Institute for Food and Drug Control,Jinan 250101,China)

An analytical method was developed for the determination of melamine and sulbactam in raw milk and liquid milk using hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry(HILIC-MS/MS). The samples were extracted with 2% acetic acid solution,and the protein was precipitated with acetonitrile subsequently. The separations of melamine and sulbactam were carried out on an Acquity UPLC BEH HILIC column using ammonium acetate solution-acetonitrile as mobile phase. The target compounds were carried out in the multiple reaction monitoring(MRM)mode by employing the external standard method. The quantitation limit of mlamine was10 μg/kg. The recovery of melamine was 85.4%～102.5%,with the RSD of 3.10%～6.55%. The quantitation limit of sulbactam was 1.0 μg/kg. The recovery of sulbactam was 86.1%～104.3%,with the RSD of 2.35%～5.37%. With the advantages of convenience,sensitivity,good recoveries and repeatability,the method was suitable for the detection of melamine and sulbactam in raw milk and liquid milk.

melamine;sulbactam;hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry(HILIC-MS/MS);raw milk;liquid milk

2017-02-20

薛霞(1979-),女,碩士,高級工程師,研究方向:食品安全分析及風險預警,E-mail:xuexia9549@163.com。

*通訊作者:王駿(1972-),男,本科,研究員,研究方向:食品安全分析及風險預警,E-mail:13953105081@163.com。

山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF120018)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)15-0244-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.045