腦膠質(zhì)瘤中RAD18的表達(dá)與放射治療抵抗相關(guān)性分析

徐延斌 麻旭東 謝 晨 詹 奇 任付賓

·基礎(chǔ)研究·

腦膠質(zhì)瘤中RAD18的表達(dá)與放射治療抵抗相關(guān)性分析

徐延斌 麻旭東 謝 晨 詹 奇 任付賓

目的 探討RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)放射抵抗的相關(guān)性，以期為改善腦膠質(zhì)瘤放射抵抗提供新的治療靶點(diǎn)。方法 將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172分別轉(zhuǎn)染空白和裝有RAD18的質(zhì)粒載體，應(yīng)用克隆實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)相同劑量射線照射后兩組細(xì)胞增殖情況，最后采用qRT-PCR方法檢測原發(fā)性及放射性粒子近距離治療后復(fù)發(fā)性GBM樣本中RAD18 mRNA的表達(dá)情況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 經(jīng)轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒過表達(dá)的GBM細(xì)胞經(jīng)放射治療后增殖情況高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的GBM細(xì)胞(P<0.001)；經(jīng)近距離放射性粒子治療后復(fù)發(fā)性GBM中RAD18 mRNA的表達(dá)水平高于原發(fā)性GBM(P<0.01)。結(jié)論 復(fù)發(fā)性GBM放射治療的抵抗性可能與RAD18的蛋白過表達(dá)有關(guān)。

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；RAD18；放射性粒子

放射治療是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)的主要治療手段之一，也是術(shù)后治療的首選方式[1]。近年來，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，放射性粒子近距離植入使得放射治療更加精準(zhǔn)[2]。經(jīng)過悉心治療，也有很大一部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，對(duì)放射治療出現(xiàn)抵抗[3]。復(fù)發(fā)的原因與腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療產(chǎn)生抵抗性有關(guān)。放射治療的靶標(biāo)是腫瘤細(xì)胞的DNA分子，DNA損傷后的修復(fù)能力與腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的有效性密切相關(guān)[4-5]。泛素系統(tǒng)在DNA損傷后修復(fù)過程中起著不可或缺的作用，RAD18是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，具有泛素連接酶E3特有的典型RING結(jié)構(gòu)[6]。RAD18在直腸癌、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤等多個(gè)惡性腫瘤中表達(dá)增加[7-9]。本研究通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床資料的分析，探究RAD18和GBM放射性粒子近距離治療抵抗的相關(guān)性，以期為改善腦膠質(zhì)瘤放射抵抗提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

A172(人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；NHAs(正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞)購自美國Lonza公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Amresco公司；胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；磷酸鹽(PBS)粉、青鏈霉素混合液購自北京Solarbio生物科技有限公司；pcDNA3.1質(zhì)粒購自美國Addgene公司；氨基糖甙類新霉素衍生物Geneticin(G418)、氯仿、EDTA購自美國Sigma公司；RIPA裂解液購自美國Cell Signaling公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)購自美國Thermo Scientific公司；Bradford試劑盒、羊抗鼠IgG購自美國Bio-Rad公司；抗RAD18購自美國Sigma-Aldrich公司；β-actin購自美國Bethyl Laboratories公司。

1.2 臨床資料

10例人腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織納入本研究，組織標(biāo)本均來源于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院2007—2015年間手術(shù)患者，其中5例為經(jīng)過手術(shù)及放射性粒子近距離治療后復(fù)發(fā)性GBM，5例為原發(fā)性GBM。膠質(zhì)瘤標(biāo)本由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床病理醫(yī)師按照世界衛(wèi)生組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立確診。其中男性患者6例，女性患者4例；患者年齡31～76歲，平均年齡48.5歲；腫瘤位置：額葉5例，顳葉1例，頂枕葉4例。收取的所有標(biāo)本于手術(shù)切除后即放置于-80℃超低溫冰箱中保存。本實(shí)驗(yàn)研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與者知情并同意。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) A172細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。NHAs置于含重組人表皮生長因子、胰島素、氨基酸、GA-1000、左旋谷氨酰胺及5%胎牛血清的培養(yǎng)基中孵育。

1.3.2 Western blot檢測A172及NHAs中RAD18蛋白質(zhì)的表達(dá) 分別收集正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞，冰PBS漂洗2次，加入RIPA裂解液，冰上靜置5 min。吸入預(yù)冷的1.5 mL EP管中，應(yīng)用超聲破碎細(xì)胞，1～2 s/次，間隔5～10 s重復(fù)一次，總共10～20次。超聲破碎細(xì)胞后將其置入離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速離心30 min。應(yīng)用Bradford試劑盒檢測RAD18蛋白濃度。取等濃度蛋白樣品置于12% SDS-PAGE凝膠中電泳，積層膠部分50～60 V，分離膠部分90～100 V，跑膠1.5 h。然后將膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上。膜上加入1∶250稀釋的鼠抗人RAD18一抗，室溫下孵育2 h。洗膜3次，15 min/次。然后加入1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG二抗，室溫下孵育1 h，洗膜3次。應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)觀察信號(hào)。同樣方法檢測β-actin內(nèi)參蛋白，通過RAD18與內(nèi)參之間條帶灰度的比值，分析RAD18蛋白的相對(duì)含量。

1.3.3 A172細(xì)胞系轉(zhuǎn)染及細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 將A172細(xì)胞系轉(zhuǎn)染裝有RAD18的質(zhì)粒載體及空白質(zhì)粒載體A172細(xì)胞用EDTA消化成細(xì)胞懸液，以1×105/2.5 mL/孔，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，加入4 μg預(yù)裝RAD18的pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，陰性對(duì)照組加入空白pcDNA3.1質(zhì)粒。操作過程參照Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。孵育48 h后，更換培養(yǎng)液，加入含600 μg/mL的新霉素衍生物Geneticin(G418)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。在篩選培養(yǎng)基中孵育4周后，應(yīng)用G418篩選有抗性的細(xì)胞。用Western blot方法檢測兩組RAD18表達(dá)變化。轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒及空白質(zhì)粒的細(xì)胞在含300 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育。

1.3.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將已轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒載體及空白質(zhì)粒載體的A172細(xì)胞，以1×103/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞分兩組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別接受2 Gy γ射線照射。在含300 μg/mL G418的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育10～14 d，每3 d更換一次條件培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞形成肉眼可見克隆的時(shí)候，終止孵育。以細(xì)胞數(shù)目超過50個(gè)的孤立細(xì)胞群作為判斷克隆的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算克隆形成數(shù)量。移去細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用冷甲醇固定克隆細(xì)胞約15 min。棄除固定液，滴入結(jié)晶紫染色。

1.3.4 qRT-PCR對(duì)比原發(fā)及復(fù)發(fā)GBM標(biāo)本中RAD18 mRNA的表達(dá)情況 采用試劑盒提取組織標(biāo)本中的總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行?？俁NA應(yīng)用隨機(jī)引物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化成cDNA。PCR擴(kuò)增條件：95℃溫度下預(yù)變性3 min，然后于95℃變性10 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。RAD18引物序列：上游引物5′-TTCACAAAAGGAAGCCGCTG-3′；下游引物5′-TTACTGAGGTCATATTATCTTC-3′。內(nèi)參GAPDH的引物序列：上游引物5′-GAAGGT-GAAGGTCGGAGTC-3′；下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。利用2-△△CT的方法計(jì)算分析，基因的表達(dá)水平以GAPDH的表達(dá)量為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)分析基因的表達(dá)水平變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RAD18在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

應(yīng)用Western blot方法檢測RAD18蛋白顯示，A172細(xì)胞系中RAD18蛋白表達(dá)(0.18±0.01)與NHAs(0.19±0.01)相近，兩者都是低表達(dá)或不表達(dá)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.2 超表達(dá)RAD18的A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)γ射線抵抗性增加

經(jīng)轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172細(xì)胞的RAD18蛋白表達(dá)(0.90±0.11)高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體組的RAD18蛋白表達(dá)(0.21±0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)(圖2)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示兩組的細(xì)胞量都在減少，到14天時(shí)，以超過50個(gè)孤立的細(xì)胞群作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒的A172細(xì)胞經(jīng)過同等劑量γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量(158.70±14.36)高于空白質(zhì)粒A172細(xì)胞(53.33±11.50)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)(圖3)。

圖1 Western blot方法檢測RAD18在正常人類星形膠質(zhì)細(xì)胞中和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of RAD18 protein in NHAs and glioma cell lines was detected by Western blot

圖3 轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒和空白質(zhì)粒載體的A172細(xì)胞系接受2 Gyγ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)Figure 3 The number of clones in A172 cells transfected with RAD18 and blank plasmid after IR treatment(2 Gy)Note：***P<0.001，compared to the blank plasmid group.

圖2 Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒或空白對(duì)照質(zhì)粒載體的A172細(xì)胞系中RAD18蛋白的表達(dá)Figure 2 The expression of RAD18 protein was analyzed in A172 cells transfected with RAD18 and blank plasmids by Western blot.Note：***P<0.001，compared to the blank plasmid group.

2.3 qRT-PCR檢測原發(fā)性及復(fù)發(fā)性GBM標(biāo)本中RAD18 mRNA的表達(dá)

經(jīng)放射性粒子近距離治療后復(fù)發(fā)性GBM標(biāo)本中RAD18 mRNA表達(dá)(14.13±2.67)高于原發(fā)性GBM標(biāo)本(7.12±2.60)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖4)。

圖4 RAD18在原發(fā)性及復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤樣本中表達(dá)情況Figure 4 The mRNA expression of RAD18 in primary and recurrent glioblastoma multiforme(GBM)samplesNote：**P<0.01，compared to the primary GBM.

3 討論

RAD18是泛素蛋白酶體系統(tǒng)的重要成分之一，參與多種蛋白酶的表達(dá)，對(duì)維護(hù)細(xì)胞正?；钚约斑z傳物質(zhì)穩(wěn)定性起重要作用。因此，RAD18成為近年來腫瘤學(xué)及遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。有研究表明RAD18也在惡性膠質(zhì)瘤中特異性表達(dá)[9]。本研究選取的細(xì)胞系A(chǔ)172為RAD18低表達(dá)的細(xì)胞系，與正常人星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量相近。通過轉(zhuǎn)染使低表達(dá)的A172細(xì)胞系RAD18表達(dá)水平增高，其接受同等劑量照射后，細(xì)胞增殖能力明顯高于普通的A172細(xì)胞。證明體外實(shí)驗(yàn)中，RAD18的表達(dá)水平可以影響腦膠質(zhì)瘤對(duì)放射治療的抵抗性。具體作用機(jī)制可能與RAD18抑制凋亡、增加DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力有關(guān)[8]。放射治療不可避免的引起DNA損傷，當(dāng)DNA損傷發(fā)生后，RAD18可被招募至DNA損傷位點(diǎn)，與泛素結(jié)合酶RAD6結(jié)合形成二聚體，促使增殖細(xì)胞核抗原發(fā)生單泛素化[10]。經(jīng)過泛素化的增殖細(xì)胞核抗原向下游的效應(yīng)器發(fā)出信號(hào)，通過招募DNA聚合酶到損傷部位對(duì)受損DNA進(jìn)行修復(fù)[11-13]。有研究顯示，RAD18不僅對(duì)跨損傷DNA合成有調(diào)節(jié)作用，也參與氧化損傷修復(fù)[4，14]。RAD18作為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)放射治療引起的腫瘤細(xì)胞DNA損傷可能有修復(fù)作用。

放射性粒子近距離治療是將放射性核素粒子種植到腫瘤內(nèi)部或周圍，通過持續(xù)釋放的射線達(dá)到殺傷腫瘤的目的。它較傳統(tǒng)的放療相比，一定程度提高了放射治療的有效性，但是不可避免的還是會(huì)出現(xiàn)放射抵抗這一現(xiàn)象[2]。本研究通過收集外科手術(shù)獲得了5例經(jīng)放射性粒子近距離治療后復(fù)發(fā)性GBM標(biāo)本，并與原發(fā)性患者標(biāo)本相比，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性GBM的RAD18 mRNA表達(dá)量明顯高于原發(fā)性，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，在活體上從一定程度上證實(shí)了GBM對(duì)放射治療的抵抗性與RAD18的表達(dá)量相關(guān)。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)分析原因，可能是因?yàn)榉派渲委熞餌NA損傷后，RAD18對(duì)DNA修復(fù)起到了重要調(diào)節(jié)作用，提高了受損DNA的修復(fù)能力，減少了腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，由此導(dǎo)致GBM患者產(chǎn)生放射抵抗。因此，若以RAD18為靶點(diǎn)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制RAD18表達(dá)，或許能夠緩解GBM患者產(chǎn)生放射抵抗，為放射治療提高療效。但是由于本研究的樣本量比較少，得出的結(jié)論仍需更大樣本量、活體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，除了DNA損傷修復(fù)以外，腫瘤對(duì)放療抵抗的機(jī)制還有：腫瘤干細(xì)胞、腫瘤乏氧、基因突變、自噬增強(qiáng)、MicroRNAs調(diào)節(jié)異常及血管生長因子過表達(dá)等因素[15]。希望通過對(duì)RAD18的深入研究，聯(lián)合其他機(jī)制，找到更有效的方法，來解決膠質(zhì)瘤對(duì)放射治療抵抗的難題。

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(收稿：2016-12-06)

Correlation between RAD18 expression and radiotherapy resistance in glioblastoma multiforme

XUYanbin，MAXudong，XIEChen，ZHANQi，RENFubin

Department of Micro-Neurosurgery，The Fourth Hospital Affiliated of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

Objective The objective of this study was to investigate the relationship between the expression of RAD18 and radiation resistance in glioblastoma multiforme(GBM)and to provide a new therapeutic target for improving the radiation resistance of GBM.Methods Human glioma A172 cells were transfected into blank and RAD18-containing plasmid vector.The cell proliferation of two groups after the same dose radiation was detected by cloning assay.The mRNA expression of RAD18 in primary and recurrent GBM samples after close proximity treatment were detected by qRT-PCR.All data were analyzed statistically.Results The proliferation of GBM cells transfected with RAD18 plasmid was higher than that of cells transfected with blank plasmid after radiation therapy(P<0.001).The expression level of RAD18 mRNA in recurrent GBM was higher than that in the untreated radioactive granules primary GBM(P<0.01).Conclusion The resistance of recurrent GBM to radiotherapy may be associated with the overexpression of RAD18 protein.

Glioblastoma multiforme；RAD18；Radioactive particles

黑龍江省科技攻關(guān)一般項(xiàng)目(GC12C303-3)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2013102)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院微創(chuàng)神經(jīng)外科(哈爾濱 150001)

徐延斌，男，(1961-)，碩士，副主任醫(yī)師，從事膠質(zhì)瘤診斷與治療的研究。

謝晨，E-mail：xcldj@126.com

R739.41

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.001