土黨參莖段的愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

戚甫友，范偉軍，胡 秀，梁韓枝，吳永清，許炳強(qiáng)

(1.廣州普邦園林股份有限公司，廣東 廣州 510600； 2.臺山市紅嶺種子園，廣東 臺山529223； 3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 園藝園林學(xué)院，廣東 廣州510225； 4.中國科學(xué)院 華南植物園，廣東 廣州510650)

土黨參莖段的愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

戚甫友1，范偉軍2，胡 秀3，*，梁韓枝3，吳永清3，許炳強(qiáng)4

(1.廣州普邦園林股份有限公司，廣東 廣州 510600； 2.臺山市紅嶺種子園，廣東 臺山529223； 3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 園藝園林學(xué)院，廣東 廣州510225； 4.中國科學(xué)院 華南植物園，廣東 廣州510650)

為了建立土黨參愈傷組織途徑的高效再生體系，以無菌苗的帶芽莖段為外植體，接種于含有不同植物激素的MS培養(yǎng)基中，探討不同植物激素對愈傷組織誘導(dǎo)、再分化出芽以及生根的影響。結(jié)果表明：在不同處理中可獲得2種類型的愈傷組織，黃色致密愈傷(類型Ⅰ)和雜夾有少量白色球形體細(xì)胞胚的黃色疏松愈傷(類型Ⅱ)，細(xì)胞分裂素主導(dǎo)著愈傷組織類型的形成。米黃色致密狀胚性愈傷(類型Ⅰ)的適宜配方為MS+1.0 mg·L-12，4-D+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，米黃色疏松愈傷組織(類型Ⅱ)的適宜配方為MS+1.0 mg·L-12，4-D。致密愈傷組織在含有細(xì)胞分裂素(6-BA、KT、TDZ)的培養(yǎng)基上可分化出芽點(diǎn)進(jìn)而形成不定芽塊，轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基后，芽伸長并增殖為叢生芽。單芽體經(jīng)300 mg·L-1IBA溶液浸泡15 min 后，轉(zhuǎn)接于不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上，生根率為100%；將生根良好的植株移栽到泥炭土、蛭石、珍珠巖體積比1∶1∶1的基質(zhì)中培養(yǎng)30 d，成活率為73.3%。通過愈傷組織途徑建立了土黨參的高效再生體系，為種苗繁育、多倍體育種、轉(zhuǎn)基因操作和細(xì)胞突變育種提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

土黨參；愈傷組織；叢生芽；生根率；成活率

土黨參(CampanumoeajavanicaB1.)，又名金錢豹，為桔?？?Campanulaceae)金錢豹屬(Campanumoea)多年生纏繞草本，分布于貴州、四川、云南、廣東和廣西等地的山地、林緣、疏林下、灌木叢及溪谷等較陰濕的地方[1]。土黨參根部提取物含有金錢豹苷、黨參苷、黃酮、苯丙素苷、甾類等化學(xué)成分，具抗癌、提高免疫、抗血管生成、抗疲勞、抗氧化和提高耐缺氧能力[2-14]，土黨參多糖與氯化鐵配合而成的鐵配合物還可作為新型的補(bǔ)鐵劑[15]。土黨參不但具有較高的藥用價值，同時也是傳統(tǒng)的食療材料。我國民間取其曬干的根用于燉雞、燉瘦肉等，不但味道鮮美而且具有補(bǔ)氣、止血、通乳等作用[16]。近年來，土黨參作為新興的食療營養(yǎng)保健品深受我國以及東南亞國家人民的青睞，國內(nèi)外市場對其需求量呈增長趨勢。由于具有良好的耐陰性，在林下種植可大大地節(jié)省土地資源，在林下經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中前景廣闊。目前，國內(nèi)外對土黨參繁殖方面的研究較少，主要集中于播種繁殖和叢芽途徑的離體繁殖[17]，沒有以愈傷組織或體細(xì)胞胚發(fā)生途徑進(jìn)行植株再生的報道。愈傷組織或體細(xì)胞胚再生途徑可在短時間內(nèi)高效地獲得再生植株，再生植株大部分是由單細(xì)胞或少量幾個細(xì)胞起源，可在細(xì)胞水平上研究細(xì)胞的分化和胚胎的形成以及用于轉(zhuǎn)基因研究。另外，體細(xì)胞胚還可以制成人工種子?；诖?，本研究采用不同種類及濃度的植物激素，以無菌苗的帶芽莖段為材料，建立土黨參愈傷組織再生體系，為土黨參的種苗繁育、多倍體育種、轉(zhuǎn)基因操作和細(xì)胞突變育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

土黨參成熟果實(shí)，于2016年7～8月采集于中國科學(xué)院華南植物園高山極地植物溫室區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為Murashige and Skoog (MS)[18]，培養(yǎng)基配方：蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，以及不同種類和濃度的植物激素，pH 5.8。培養(yǎng)基在121 ℃、104 kPa條件下滅菌20 min。接種后置于溫度(25±1)℃，12 h/12 h(L/D)條件下，在無菌培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)(如無特別說明，以下培養(yǎng)條件均與此相同)。

1.2.2 無菌體系的建立

將土黨參果實(shí)在流水下沖洗1.5 h，置于超凈工作臺上晾干表面水分，75%乙醇溶液浸泡1 min，無菌水沖洗1次，濾紙吸干，在0.1%升汞溶液中浸泡15 min，期間不斷攪拌，無菌水漂洗6次，晾干表面水分。在無菌濾紙上用無菌鑷子和刀片剝開果皮，取種子接種于不含任何植株激素的MS培養(yǎng)基上。種子在20 d左右開始萌發(fā)，40 d長成高4～6 cm，帶2～3個節(jié)的幼苗。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

切取無菌苗帶芽莖段(長約1 cm)，橫放于含有不同濃度2， 4-D(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)、6-BA(0、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.5 mg·L-1)和TDZ(0、0.1 mg·L-1)及其組合的MS培養(yǎng)基上，在光照下培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。為探討光照條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，將部分帶芽莖段接種于含1.0 mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基，置于黑暗下培養(yǎng)。每個處理接種45個莖段，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后觀察愈傷組織生長情況，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織的莖段數(shù)量/接種數(shù))×100%。

1.2.4 愈傷組織再分化出芽

將誘導(dǎo)出的愈傷組織塊切為1 cm × 1 cm大小，轉(zhuǎn)接至含有不同濃度的6-BA(0、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.01、0.1 mg·L-1)、TDZ(0、0.01、0.1 mg·L-1)及其組合的培養(yǎng)基上，30 d后觀察記錄愈傷組織再分化出芽情況并統(tǒng)計(jì)出芽誘導(dǎo)率與平均芽數(shù)，出芽率=出芽的愈傷組織塊數(shù)/接種數(shù))×100%；平均出芽數(shù)=芽總數(shù)/接種時愈傷組織塊數(shù)。每個處理接種45個莖段，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 芽的伸長與擴(kuò)繁

切取相同大小(2 cm × 2 cm)的不定芽塊轉(zhuǎn)接于含有不同濃度6-BA(0、0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.1、0.5 mg·L-1)、KT(0、0.5 mg·L-1)、TDZ(0、0.1、0.3、0.5 mg·L-1)、GA3(0、0.5、2.0 mg·L-1)及其組合的MS培養(yǎng)基上，30 d后觀察記錄生長情況，并統(tǒng)計(jì)芽伸長率、平均芽伸長數(shù)與芽增殖率。芽伸長率=(長于0.5 cm的不定芽塊數(shù)/接種時的總不定芽塊數(shù))×100%；平均芽伸長數(shù)=長度大于0.5 cm的總芽體數(shù)/接種時的不定芽塊數(shù)；芽增殖率=(出現(xiàn)增殖的芽數(shù)/接種時的芽數(shù))×100%。每個處理接種45個莖段，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 生根培養(yǎng)

選取長3～4 cm、生長健壯的枝條，切離不定芽塊并將切口以上長0.2～0.5 cm部分置于300 mg·L-1IBA溶液浸泡15 min，轉(zhuǎn)接于不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 d后觀察記錄其生長情況，并統(tǒng)計(jì)生根率與平均生根數(shù)。生根率=(生根數(shù)/接種數(shù))×100%，平均生根數(shù)=總根數(shù)/生根的植株數(shù)量。每個處理接種45個莖段，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 煉苗移栽

選擇生根良好的植株，去除蓋子，帶瓶置于自然光照條件下培養(yǎng)7 d后，用自來水小心沖洗根系附著的培養(yǎng)基，略微晾干根系表面水分，植于泥炭土、蛭石、珍珠巖體積比1∶1∶1的花盆中，澆足定根水，每天早晚用清水噴灑葉面，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。移栽成活率=(30 d后移栽成活的植株數(shù)/移栽總株數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采DPS 7.05軟件中的Duncan新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素配比及光照對土黨參愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)10 d左右，莖段切口處開始膨大并形成愈傷組織。在不同激素配比下，土黨參的愈傷組織誘導(dǎo)率呈顯著性差異。在不含植物激素的培養(yǎng)基中不能形成愈傷組織，生長素單用以及與細(xì)胞分裂素合用均可形成愈傷組織(表1)。細(xì)胞分裂素(6-BA、TDZ)主導(dǎo)著愈傷組織類型的形成，在同時添加2，4-D與6-BA或TDZ的培養(yǎng)基上可產(chǎn)生米黃色致密狀胚性愈傷(類型Ⅰ，圖1-A)，而單獨(dú)添加2，4-D時則產(chǎn)生含有少量白色球形胚的米黃色疏松狀愈傷(類型Ⅱ，圖1-B)。

愈傷組織誘導(dǎo)率與2，4-D濃度呈正相關(guān)，2，4-D濃度越高則愈傷組織誘導(dǎo)率越高，最高可達(dá)86%；但當(dāng)2，4-D濃度達(dá)1.0 mg·L-1以上時，差異不顯著。低濃度2，4-D誘導(dǎo)的愈傷組織生長旺盛，分裂速度較快，高濃度的2，4-D(≥2.0 mg·L-1)誘導(dǎo)的愈傷生長緩慢，在培養(yǎng)后期甚至出現(xiàn)部分褐化的現(xiàn)象。因此，高濃度的2，4-D可在一定程度上抑制土黨參愈傷組織的生長甚至對其產(chǎn)生了一定的毒害作用。另外，無論是在12 h光照/12 h黑暗處理還是在全黑暗處理的情況下，土黨參莖段愈傷組織誘導(dǎo)率以及相應(yīng)的生長情況并沒有顯著差異，可見土黨參愈傷組織的形成對光照條件要求不嚴(yán)格。

2.2 激素配比對類型Ⅰ愈傷組織再分化出芽的影響

致密愈傷組織(類型Ⅰ)在單獨(dú)含有細(xì)胞分裂素(6-BA或TDZ)或與GA3相配合的培養(yǎng)基上均可再分化出不同程度的芽點(diǎn)(圖1-C)，而不含任何植物激素的對照組(CK)則產(chǎn)生大量根并褐化死亡，推測細(xì)胞分裂素是愈傷組織再分化出芽的必要條件。雖然單獨(dú)使用6-BA或TDZ均可誘導(dǎo)芽的分化，但是誘導(dǎo)再分化出芽的效果卻有顯著差異。TDZ誘導(dǎo)效果最高，TDZ濃度為0.5～1.5 mg·L-1時，出芽率和平均芽點(diǎn)數(shù)隨著濃度的升高而增加，最高分別可達(dá)81.4%和203個。雖然分化出的芽體葉片均為卷縮，芽點(diǎn)均不能伸長形成正常態(tài)的嫩芽，在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)30 d后芽體依然不能伸長形成常態(tài)芽，但可使不定芽塊長大并出現(xiàn)更多的芽點(diǎn)(表2)。

表1 不同植物激素及其組合對土黨參莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table 1 Effects of different phytohormone and their combinations on callus induction ofC.javanicafrom stem with axillary bud

植物激素Phytohormones/(mg·L-1)2,4-D6-BANAATDZ愈傷組織誘導(dǎo)率Callus-inducedrate/%愈傷組織類型Typeofcallus光照條件Lightcondition00000d—光培養(yǎng)Light0.500055c類型Ⅱ(疏松)TypeⅡ(loose)光培養(yǎng)Light0.51.00065bc類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light0.51.00.5054c類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light1.000078.7ab類型Ⅱ(疏松)TypeⅡ(loose)光培養(yǎng)Light1.000072ab類型Ⅱ(疏松)TypeⅡ(loose)暗培養(yǎng)Dark1.01.00076ab類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light1.01.00.5086a類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light1.0000.181.3a類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light2.000073ab類型Ⅱ(疏松)TypeⅡ(loose)光培養(yǎng)Light2.01.00078ab類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light2.01.00.5085a類型Ⅰ(致密)TypeⅠ(compact)光培養(yǎng)Light

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同；類型Ⅰ，黃色致密愈傷；類型Ⅱ，米黃色疏松愈傷。

Values represented means in three repeated tests. Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. Type Ⅰ， yellow and compact callus; TypeⅡ， beige and loose callus.

在含有不同濃度6-BA(0.5、1.0 mg·L-1)與TDZ(0.01、0.1 mg·L-1)組合的培養(yǎng)基上，致密的愈傷組織在培養(yǎng)10 d左右開始變得松散，同時開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。培養(yǎng)30 d后該愈傷組織出現(xiàn)的芽點(diǎn)不能伸長，只是疏松的愈傷組織出現(xiàn)了部分增殖。取含該綠色芽點(diǎn)的疏松愈傷組織于體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在綠色芽點(diǎn)當(dāng)中雜夾著少量的球形胚(圖2-A)和心形胚(圖2-B)；胚根伸長形成根，但胚芽愈傷化并長出次級體細(xì)胞胚的“畸形成熟胚”，無正常的成熟胚(圖2-C)，同時還發(fā)現(xiàn)在部分球形胚上面也長出了次級體細(xì)胞胚(圖2-D)。由此可知，6-BA與TDZ的協(xié)同作用有助于體細(xì)胞胚的形成，但是體細(xì)胞胚形成的質(zhì)量較差。

表2 不同植物激素及其組合對Ⅰ類愈傷組織再分化的影響

Table 2 Effects of different phytohormone and their combinations on differentiation of callus type Ⅰ

植物激素Phytohormones/(mg·L-1)6-BATDZNAAGA3出芽率Shootinductionrate/%平均芽數(shù)Numberofshoots愈傷組織分化情況Performanceofcallusdifferentiation00000g0i大量根,愈傷褐化Plentifulrootandbrown0.500069.0b45.0g芽簇生緊密Fascicular1.000062.5bc104.0d芽簇生緊密Fascicular00.50079.5a148c芽簇生緊密Fascicular01.00081.4a188.5b芽簇生緊密Fascicular01.50080.8a203.0a芽簇生緊密Fascicular0.50.10061.5bc62.5f愈傷組織塊松散Loose,shootsparse1.00.10068b89.0e愈傷組織塊松散Loose,shootsparse0.500.1028.2f29.5h愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot1.000.1027.7f24.0h愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot2.000.1038.5e28.0h愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot0.5000.557.5c104.5d芽簇生緊密Fascicular1.000.01030.4f18.0h愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot00.500.577.6a158c芽簇生緊密Fascicular0.50.10.1040.6de103d愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot0.500.10.528.5f64.0f愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot1.00.10.01045.9d82.0e愈傷組織塊松散,芽稀少,大量根Loose,shootsparseandplentifulroot

A， 莖段在1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA的MS培養(yǎng)基上形成的黃色致密愈傷組織(類型Ⅰ)；B， 莖段在1.0 mg·L-1 2，4-D的MS培養(yǎng)基上形成的黃色疏松愈傷組織(類型Ⅱ)，且該愈傷組織雜夾少量白色球形體細(xì)胞胚；C， 類型Ⅰ愈傷組織在1.0 mg·L-1 TDZ培養(yǎng)基上長出致密芽點(diǎn)；D， 不定芽塊上的芽體在0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 GA3的培養(yǎng)基上伸長；E， 健壯的叢生芽經(jīng)300 mg·L-1IBA浸泡15 min后接種于不含任何激素的空白MS培養(yǎng)基上生根；F， 移栽成活的無菌苗。圖中標(biāo)尺代表的實(shí)際長度為0.5 mmA， Yellow and compact callus (Type Ⅰ)was induced on MS medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA; B， Yellow and fragile callus (type Ⅱ) was induced on MS medium supplemented with 1.0 mg·L-1 2，4-D and formed a few white globular embryos; C， The compact callus could differentiated into adventitious buds on the medium supplementing 1.0 mg·L-1 TDZ; D， The shoots were elongated on MS medium supplemented with 0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 GA3; E， Excised shoots rooted after treated with 300 mg·L-1 IBA for 15 min and cultured on MS basal medium for 30 d; F， Plantlets were survival after transplanted into matrix. Bars=0.5 mm圖1 土黨參愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生Fig.1 Plant regeneration via callus from aseptic stems of C. javanica.

含有NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織均可再分化產(chǎn)生大量的根，但芽分化率與出芽程度均較低，僅在長滿根的致密愈傷組織塊上零星地分布一些芽，該芽體葉片舒展，芽長勢正常(表2)。

A， 球形胚；B， 心形胚；C， 畸形胚；D， 在球形胚上形成了次級體細(xì)胞胚，如白色箭頭所示。標(biāo)尺代表的實(shí)際長度為0.5 mmA， Globular embryos; B， Heart-shaped; C， Abnormal embryo; D， Secondary embryos formed on the surface of primary globular embryos (white arrow). Bars=0.5 mm圖2 處于不同時期的體細(xì)胞胚Fig.2 Somatic embryos at different stages

綜上所述，最適的誘導(dǎo)愈傷組織分化出芽培養(yǎng)基為：MS+1.5 mg·L-1TDZ；6-BA與NAA同時作用時有助于體細(xì)胞胚的形成，含有NAA的培養(yǎng)基不適合愈傷組織再分化出芽。

2.3 芽的伸長與增殖

由表3可知，GA3在簇生芽的伸長方面具有重要作用。雖然單一添加6-BA或KT的培養(yǎng)基中不定芽出現(xiàn)增殖且無褐化現(xiàn)象，但不定芽塊的芽點(diǎn)致密，不能伸長；6-BA與NAA配合使用時，部分不定芽增殖，但僅有少量的芽可以伸長，大部分芽塊出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象。在GA3培養(yǎng)基上培養(yǎng)的不定芽均可以出現(xiàn)不同程度的伸長，芽伸長率與平均芽伸長數(shù)最高分別可達(dá)90.55%與102個，幾乎整個不定芽塊的芽體都得以伸長且葉片舒展，長勢旺盛(圖1-D)。單獨(dú)添加2.0 mg·L-1GA3的培養(yǎng)基上芽長勢旺盛，但是沒有新的芽形成；當(dāng)GA3與6-BA、NAA配合使用時不定芽塊長勢最好，既有芽的伸長也有芽的增殖。由表3可知，誘導(dǎo)不定芽塊伸長的較好配方為：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1GA3。

在含有6-BA、NAA與TDZ的MS培養(yǎng)基上，雖然芽塊伸長率較低，但將伸長的芽體從不定芽塊上剝離并轉(zhuǎn)接于相同培養(yǎng)基上，在莖段的切口基部會產(chǎn)生綠色致密的愈傷組織，同時在基部產(chǎn)生大量叢生芽，可知該類培養(yǎng)基配比不適合誘導(dǎo)芽的分化與伸長，而適合于叢生芽產(chǎn)生與擴(kuò)繁。

表3 不同植物激素及其組合對土黨參芽伸長與增殖的影響

Table 3 Effects of different phytohormone and their combination on shoots elongation and propagation ofC.javanica

植物激素Phytohormones/(mg·L-1)6-BANAATDZKTGA3芽伸長率Therateofelongatedshootinduction/%平均芽伸長數(shù)NumberofshootsperAdventitiousmass芽增殖率Therateofelongateshoots/%不定芽塊生長情況Growthperformanceofshootmass000000c0c0c褐化Brown0.50.0100023.94b27.15b23.25b部分褐化Brownpartly0.50.100.100025.30b32.45b56.00a無褐化Nobrown0.50.10000.5091.00a102.00a59.10a無褐化Nobrown0.50.2000022.62b28.75b21.50b部分褐化Brownpartly1.00.1000026.27b25.00b24.00b部分褐化Brownpartly1.00.100.010029.40b33.50b54.00a無褐化Nobrown1.0000.50029.10b2.65c22.30b無褐化Nobrown00002.0090.55a100.10a0c無褐化Nobrown

2.4 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

健壯的枝條置于300 mg·L-1IBA 溶液中浸泡處理15 min后，轉(zhuǎn)接至MS無激素培養(yǎng)基上，7 d左右開始陸續(xù)生根，30 d后生根率達(dá)到100%，每株平均生根數(shù)為5.3條，植株莖稈健壯，葉片翠綠(圖1-E)。自然光照下煉苗7 d后，用自來水沖洗根部附著的瓊脂后移栽于土壤中，30 d后移栽成活率為73.3%，小苗長勢良好(圖1-F)。

3 討論

本研究以無菌苗的帶芽莖段為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，單獨(dú)使用2，4-D或與6-BA、TDZ進(jìn)行配合，分別獲得了2種類型的愈傷組織。單獨(dú)添加2，4-D誘導(dǎo)獲得的是米黃色疏松愈傷組織(類型Ⅱ)，而米黃色致密狀胚性愈傷(類型Ⅰ)的誘導(dǎo)需2， 4-D與6-BA或TDZ配合使用，表明細(xì)胞分裂素對誘導(dǎo)出的愈傷組織類型至關(guān)重要。不同質(zhì)地的愈傷組織有不同的用途，疏松易分散的愈傷組織適于懸浮培養(yǎng)，用于研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及相關(guān)藥用成分的大規(guī)模生產(chǎn)；致密的愈傷組織具有較高的繁殖效率，可為多倍體育種、轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞突變育種提供基礎(chǔ)，因此，可根據(jù)不同需求來誘導(dǎo)不同的愈傷組織。

米黃色致密狀胚性愈傷(類型Ⅰ)在單獨(dú)含有細(xì)胞分裂素(6-BA或TDZ)或與GA3相配合的培養(yǎng)基上均可再分化出數(shù)量不等的芽點(diǎn)，而在添加NAA的培養(yǎng)基上可分化出大量根但沒有芽，因此，在器官分化階段不適宜添加NAA。分化出的芽點(diǎn)均不能伸長形成正常的嫩芽，在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)30 d后不定芽塊長大，但芽體依然不能伸長形成常態(tài)芽。將不定芽塊轉(zhuǎn)移至GA3與6-BA、NAA配合的培養(yǎng)基，芽既可以伸長又可維持一定的增殖；僅采用6-BA與NAA配合可獲得一定的芽增殖率，但不能促使芽伸長，表明GA3在芽的伸長中具有重要作用。本研究中，實(shí)現(xiàn)土黨參愈傷組織再分化出正常芽需要2步，即先將愈傷組織誘導(dǎo)出含有密集芽點(diǎn)的不定芽塊，再將該芽塊繼代于含有GA3的芽伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行芽伸長誘導(dǎo)，這與杜鵑花[19]、印度黃檀[20]以及菜花[21]等植物的植株再生過程相一致。

米黃色致密狀胚性愈傷(類型Ⅰ)在含有不同濃度6-BA(0.5、1.0 mg·L-1)與TDZ(0.01、0.10 mg·L-1)組合的培養(yǎng)基上再分化出芽時，還觀察到了體細(xì)胞胚的形成，但所占比例較小，后續(xù)研究可嘗試調(diào)整6-BA與TDZ的濃度，提高此類愈傷組織分化成體細(xì)胞胚的比例。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究單獨(dú)添加2，4-D誘導(dǎo)獲得的米黃色疏松愈傷組織(類型Ⅱ)。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

Callus induction and plant regeneration from stem explants ofCampanumoeajavanicaB1.

QI Fuyou1， FAN Weijun2， HU Xiu3，*， LIANG Hanzhi3， WU Yongqing3， XU Bingqiang4

(1.GuangzhouPubangLandscapeArchitectureCo.，Ltd，Guangzhou510600，China; 2.HonglingSeedOrchard，Taishan529223，China; 3.CollegeofHorticultureandLandscapeArchitecture，ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering，Guangzhou510225，China; 4.SouthChinaBotanicalGarden，ChineseAcademyofSciences，Guangzhou510650，China)

In order to estabilished an efficient plant regeneration system via callus from stem segments with bud ofCampanumoeajavanicaB1. The aseptic stems were used as explants and then cultured on MS medium supplemented with different plant growth regulators (PGRs) to establish an effective protocol for callus induction， shoots induction and development， and roots induction. The results showed that two types of callus could be obtained under different treatments， of which type Ⅰ was yellow and compact while type Ⅱ was light yellow， fragile and mixed with a small number of white globular embryos. The type of callus could be regulated by cytokinin. Type I callus was induced on MS medium supplemented with 1.0 mg·L-12， 4-D+1.0 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA， while type Ⅱ callus was induced on MS medium supplemented with 1.0 mg·L-12， 4-D. The compact callus could differentiated into adventitious buds on the medium supplementing cytokinin (6-BA， KT， TDZ). The adventitious buds further developed and proliferated after 30 d culture on MS medium containing 0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3+0.1 mg·L-1NAA. Excised shoots were treated with 300 mg·L-1IBA for 15 min and then cultured on MS basal medium for 30 d， and the rooting rate reached 100%. When transplanted into a mixture of peat soil， vermiculite and perlite (volume ratios was 1∶1∶1)， the survival rate of regenerated plantlets could reached 73.3% after 30 d. The experiment developed an effective protocol forC.javanicashoot organogenesis via callus， which might laid the foundation of researches on polyploidy， transgenic and cell mutation breeding.

CampanumoeajavanicaB1.; callus; excised shoots; rooting rate; survival rate

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.12

2017-04-19

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金(2013KJCX014-02，2015KJCX039)；廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金(pdjh2016b0253)

戚甫友(1982—)，男，山東梁山人，碩士，工程師，主要從事風(fēng)景園林施工。E-mail: 272741918@qq.com

*通信作者，胡秀，E-mail: 13902215936@139.com

S567.23+9

A

1004-1524(2017)08-1313-08

戚甫友， 范偉軍， 胡秀， 等. 土黨參莖段的愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2017， 29(8): 1313-1320.