分子標(biāo)記在我國番茄抗病育種的應(yīng)用研究進展

陳遠松，朱曉偉，龔翔宇，梅至誠，祝 彪

(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，生物種業(yè)研究中心，浙江 臨安 311300)

分子標(biāo)記在我國番茄抗病育種的應(yīng)用研究進展

陳遠松，朱曉偉，龔翔宇，梅至誠，祝 彪*

(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，生物種業(yè)研究中心，浙江 臨安 311300)

抗病育種是當(dāng)前番茄育種的一個重要方向，分子標(biāo)記技術(shù)已成為番茄抗病育種中的重要方法之一。分子標(biāo)記技術(shù)很大程度上克服了表型選擇的局限性，能極大地縮短育種周期，已廣泛應(yīng)用于番茄的輔助育種。文章基于獻計量分析的方法，綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在中國番茄抗病育種應(yīng)用上的研究現(xiàn)狀，介紹了常用幾種分子標(biāo)記的特點，概述了番茄主要病害抗病分子標(biāo)記使用現(xiàn)狀及進展，并對存在的問題進行了討論和分析，指出今后的發(fā)展方向。

番茄病害；抗病育種；分子標(biāo)記

番茄品種豐富、種植廣泛、營養(yǎng)價值高，富含具有抗癌效果的番茄紅素等抗氧化物質(zhì)[1]，但其病害種類繁多、危害嚴重。目前，生產(chǎn)上對番茄病害的防治主要依賴于噴施化學(xué)藥劑，這不但會帶來食品安全問題，而且增加成本，污染環(huán)境。此外，隨著病菌和害蟲對藥物的抗性逐漸增強，殺菌劑、殺蟲劑的功效也大大減弱。因此，在番茄育種中培育優(yōu)良的抗病品種顯得尤為重要。

此前，絕大多數(shù)番茄品種是通過表型篩選和傳統(tǒng)育種得到的。隨著分子標(biāo)記和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的出現(xiàn)，番茄遺傳育種研究已進入一個新的時代。Rick等[2]最早在番茄育種領(lǐng)域應(yīng)用 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)進行初探，并獲得很大的突破。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建以及番茄許多重要農(nóng)藝性狀的基因和QTL的鑒定，包括抗病蟲、抗非生物脅迫，花和果實發(fā)育相關(guān)特性等[3-6]。該技術(shù)還被用于幾個重要經(jīng)濟性狀的輔助育種，尤其是抗病性上[5，7]。對于番茄的許多簡單的抗病性狀，分子標(biāo)記輔助育種不但快于傳統(tǒng)育種，而且更便宜、更有效。分子標(biāo)記技術(shù)可以從DNA水平上準(zhǔn)確、快速地鑒定抗病位點，顯著提高育種效率[3]。目前，番茄中超過35種病原體的抗性基因已被識別和定位[8-9]。

本文采用文獻計量分析的方法，從文獻時間分布、文獻來源地區(qū)分布、文獻來源機構(gòu)、各類分子標(biāo)記使用次數(shù)分析和各種番茄病害文獻數(shù)量分析等幾個方面對國內(nèi)番茄抗病分子標(biāo)記的應(yīng)用現(xiàn)狀進行研究分析，以期為番茄的抗病育種提供參考。

1 數(shù)據(jù)來源與研究方法

1.1 文獻獲取

期刊和學(xué)位論文獲?。阂浴吨袊R資源總庫(CNKI)》為數(shù)據(jù)源。采用高級檢索類型，以 “主題”為檢索項，以“番茄”并含“標(biāo)記”為檢索詞，采用“精確”匹配為檢索式，文獻檢索時間范圍為2000年1月1日至2015年12月31日，檢索庫范圍為期刊、特色期刊和學(xué)位論文。

專利文獻獲取：以《國家知識產(chǎn)權(quán)局互聯(lián)網(wǎng)檢索數(shù)據(jù)庫》為數(shù)據(jù)源，利用Soopat專利搜索平臺，在中國專利欄輸入“番茄標(biāo)記”，檢索范圍設(shè)為“發(fā)明、實用新型、發(fā)明授權(quán)”。

1.2 統(tǒng)計分析方法

首先建立Excel數(shù)據(jù)庫，然后根據(jù)分析需求，分別建立不同的工作表和不同的字段，再利用數(shù)據(jù)庫的強大支撐功能，運用文獻計量法進行研究。同時，還運用了內(nèi)容分析法和比較分析法，見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記在我國番茄抗病育種中的運用現(xiàn)狀

根據(jù)上述方法檢索得到期刊文獻360篇、學(xué)位論文445篇、專利153篇，其中226篇涉及番茄性狀相關(guān)分子標(biāo)記。上述文獻中，抗病相關(guān)的占71%；抗逆性的占7%；果實品質(zhì)、產(chǎn)量的占11%；品種、純度鑒定的占7%；雄性不育、單性結(jié)實的占4%(圖1)。顯然，分子標(biāo)記在抗病性狀的研究上應(yīng)用最多。排除了與分子標(biāo)記無關(guān)和分子標(biāo)記在其他方面應(yīng)用等文獻以及數(shù)據(jù)不全的期刊和學(xué)位論文，排除了不在2000—2015年的專利、與分子標(biāo)記無關(guān)和分子標(biāo)記在其他方面應(yīng)用等文獻以及數(shù)據(jù)不全的專利，最終得到番茄抗病分子標(biāo)記相關(guān)期刊文獻85篇，學(xué)位論文46篇，專利29篇，總計160篇。

2.2 文獻的年份分布

由圖2可知，2000—2015年文獻的發(fā)表數(shù)量總體呈上升趨勢，這表明科研工作者對分子標(biāo)記在番茄抗病育種中的研究熱度增加且不斷深入。期刊和專利發(fā)表量基本呈現(xiàn)穩(wěn)定上漲的趨勢，而學(xué)位論文在不同年份間波動較大。從總體數(shù)量上來看，期刊最多，學(xué)位論文第二，專利最少。

表1 研究方法匯總

Table 1 Study methods

研究方法Studymethods研究目的Studyaims文獻計量法Bibliometricanalysis文獻年份分布Yearlydistributionofliterature分析國內(nèi)番茄抗病分子標(biāo)記研究熱度變化Analysisontheyearlychange文獻地域分布Regionaldistributionofliterature分析比較不同地區(qū)研究狀況Analysisonthesituationsofdifferentregions文獻來源機構(gòu)分析Researchinstitutedistributionofliterature分析比較不同機構(gòu)的研究狀況Analysisonthesituationsofdifferentresearchinsti-tutes內(nèi)容分析法Contentanalysis分析文獻的研究內(nèi)容Contentanalysis比較分析法Comparativeanalysis不同類別文獻量的比較分析Comparativeanalysis

圖1 涉及番茄性狀相關(guān)分子標(biāo)記文獻分布Fig.1 The distribution of molecular markers used in tomato breeding

圖2 2000—2015年國內(nèi)番茄抗病分子標(biāo)記相關(guān)文獻數(shù)量折線圖Fig.2 The literature number of molecular markers related with tomato disease resistance during 2000 to 2015

2.3 文獻來源分析

2.3.1 文獻數(shù)目地域分析

文獻的地域分布整體上表現(xiàn)為東部多于西部，北方多于南方，主要集中于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院為代表的北京周邊科研機構(gòu)與大學(xué)，浙江、江蘇地區(qū)的大學(xué)與農(nóng)業(yè)科學(xué)院。其中東北農(nóng)業(yè)大學(xué)十分熱衷于番茄抗病分子標(biāo)記的研究與運用，131篇學(xué)位論文和期刊論文中有35篇來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)。

2.3.2 幾種主要病害研究的地域分布

根據(jù)圖3可以發(fā)現(xiàn)，番茄抗病分子標(biāo)記研究與番茄產(chǎn)地以及主要病害發(fā)生的地理分布密切相關(guān)，如北方地區(qū)對番茄花葉病毒病(ToMV)和根結(jié)線蟲病(root knot nematodes)的研究較多，而南方地區(qū)對此研究較少；對番茄花葉病毒病的研究以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院為主，但其對番茄黃化曲葉病毒病(TYLCV)的研究較少；對青枯病(bacterial wilt)分子標(biāo)記相關(guān)研究較少，主要集中在浙江大學(xué)和浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等南方地區(qū)科研機構(gòu)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)對番茄主要病害相關(guān)分子標(biāo)記都有所研究。

圖3 幾種主要病害相關(guān)文獻來源的地域分布Fig.3 The regional distribution of the study of molecular markers used in the tomato disease resistance breeding

2.4 番茄抗病育種中應(yīng)用的主要分子標(biāo)記分析

從圖4可以看出，特定序列擴增(sequence characterized amplified regions，SCAR)標(biāo)記的使用次數(shù)最多。擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)標(biāo)記、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)、酶切擴增多態(tài)性序列標(biāo)記(cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)使用次數(shù)也較多，僅次于SCAR標(biāo)記。進一步研究表明，番茄不同病蟲害所使用的分子標(biāo)記不同。

圖5表明，番茄花葉病毒病主要使用SCAR標(biāo)記，很少使用其他標(biāo)記；青枯病主要使用AFLP標(biāo)記；根結(jié)線蟲病主要使用SCAR標(biāo)記和CAPS標(biāo)記；葉霉病(leaf mold)很少使用SCAR標(biāo)記；SSR標(biāo)記的病害比例與AFLP標(biāo)記很相似，實際上SSR標(biāo)記和AFLP標(biāo)記經(jīng)常聯(lián)合使用。

從表2可以看出，分子標(biāo)記在番茄抗病育種中的使用情況與他們自身的特點密切相關(guān)。限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)最主要的缺點是由于它的產(chǎn)生是由堿基突變致使限制性酶切位點的獲得或失去，故多態(tài)位點少，信息量小。隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)技術(shù)受影響的因素多，實驗重復(fù)性和穩(wěn)定性差。CAPS分子標(biāo)記技術(shù)依賴于已發(fā)現(xiàn)的突變酶切點。AFLP技術(shù)需要使用同位素檢測。SSR標(biāo)記必須依賴測序設(shè)計引物。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記建立在大量測序或基因芯片的基礎(chǔ)上。相較其他標(biāo)記，SCAR標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、使用簡單、費用較低等明顯優(yōu)勢，所以它在番茄抗病研究上的使用最多。然而實際研究中可能影響分子標(biāo)記使用的因素有很多，如分子標(biāo)記開發(fā)難度、已開發(fā)的標(biāo)記數(shù)目、標(biāo)記的使用效果和標(biāo)記的使用成本等都會影響標(biāo)記使用。

2.5 番茄主要病害的分子標(biāo)記使用情況分析

由圖6得知，分子標(biāo)記在黃化曲葉病毒病上的運用遠多于其他病害。葉霉病和根結(jié)線蟲病也是運用分子標(biāo)記較多的病害[10-13]。黃化曲葉病毒病使用分子標(biāo)記最多的原因可能與其病害危害嚴重、防治難度大，且傳統(tǒng)育種進展緩慢、困難大，黃化曲葉病毒病抗性是一種質(zhì)量性狀、使用分子標(biāo)記育種操作難度低且抗病效果明顯有關(guān)[3]。目前，已經(jīng)定位到的黃化曲葉病毒病抗病基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5，開發(fā)的標(biāo)記種類和數(shù)目較多且經(jīng)過驗證[14-19]。

圖5 常用幾種標(biāo)記相關(guān)病害占比Fig.5 The proportion of different kinds of molecular markers used in tomato disease resistance breeding

表2 幾種主要分子標(biāo)記特點

Table 2 The characteristics of different kinds of molecular markers

標(biāo)記類型MarkerDNA質(zhì)量要求DNAqualityDNA檢測范圍DNAtestrange遺傳特點Genetictrait多態(tài)性Polymorphism技術(shù)難度Technicaldifficul-ty穩(wěn)定性Stability重復(fù)性Repeatability費用CostRFLP高High低拷貝區(qū)Lowcopyarea共顯性Codominance較低Lower高High高High高High高HighRAPD低Low整個基因組Wholegenome顯性Dominance較高Higher低Low較低Lower中等Medium低LowCAPS中等Medium整個基因組Wholegenome共顯性Codominance較高Higher中等Medium高High高High高HighAFLP高High整個基因組Wholegenome顯性Dominance較高Higher中等Medium高High高High高HighSCAR中等Medium整個基因組Wholegenome共顯性Codominance較高Higher較低Lower高High高High較低LowerSSR中高Medium-high重復(fù)序列區(qū)Repeatregion共顯性Codominance高High低Low高High高High中等MediumSNP高High整個基因組Wholegenome共顯性Codominance高High高High高High高High高High

由圖7可知，不同病害使用的標(biāo)記具有較大差異，黃化曲葉病毒病使用最多的4種標(biāo)記也是總體使用最多的分子標(biāo)記，使用量最大的SCAR標(biāo)記在葉霉病上卻使用較少，根結(jié)線蟲病很少使用AFLP和SSR標(biāo)記。

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)已成為番茄育種中重要的工具之一。本文通過文獻計量分析的方法對我國番茄抗病分子標(biāo)記的研究進展進行了分析，結(jié)果表明，分子標(biāo)記技術(shù)在番茄抗病育種上的應(yīng)用正在快速增加[20-21]。國內(nèi)番茄抗病分子標(biāo)記的研究具有明顯的地域性特點，這與番茄栽培產(chǎn)地實際和國內(nèi)主要農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)的地域分布基本吻合。各類型的分子標(biāo)記都在廣泛使用，其中SCAR標(biāo)記的使用量最大。不同病害使用分子標(biāo)記情況不同，黃化曲葉病毒病是當(dāng)前比較熱門的研究對象。從已發(fā)表文獻看，目前國內(nèi)對于番茄抗病分子標(biāo)記的研究主要集中在科研機構(gòu)，國內(nèi)育種公司在這方面的研究還不足，與國外的大公司仍有不小的差距。即使是國內(nèi)在番茄抗病分子標(biāo)記研究方面基礎(chǔ)較好的單位，目前的主要工作還在于對現(xiàn)有標(biāo)記的研究和應(yīng)用上，很少有國內(nèi)自主開發(fā)的新標(biāo)記。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在番茄育種上的應(yīng)用越來越多，自主開發(fā)新標(biāo)記和育種公司參與分子標(biāo)記的應(yīng)用研究將會是我國未來對番茄抗病分子標(biāo)記研究和應(yīng)用的主要方向。

圖6 番茄主要病害使用分子標(biāo)記技術(shù)的情況Fig.6 The utilization of molecular markers used in major disease in tomato breeding

圖7 使用分子標(biāo)記技術(shù)最多的三種主要病害分析Fig.7 The analysis of the usage of molecular markers in three major diseases in tomato

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Research advance of molecular marker-assisted selection in tomato disease resistance breeding in China

CHEN Yuansong，ZHU Xiaowei，GONG Xiangyu，MEI Zhicheng，ZHU Biao*

(ResearchCenterofBio-BreedingIndustry，SchoolofAgricultureandFoodScience，ZhejiangA&FUniversity，Lin’an311300，China)

Disease resistance breeding is an important direction of tomato breeding. Molecular marker technology largely overcomes the limitations of phenotypic selection， greatly shortens the breeding cycle， and it has been widely used in tomato breeding. This paper reviewed the history and recent advances of molecular marker technology used in tomato disease resistance breeding in China. The characteristics of the main molecular markers and the main diseases in tomato disease resistance breeding were analyzed.

tomato disease; disease resistance breeding; molecular marker

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.25

2017-02-23

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2016R412006)；浙江省教育廳科研項目(Y201432633)；浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作計劃項目(SN2014-2)；浙江農(nóng)林大學(xué)生物種業(yè)研究中心項目(2013SWZY1-5)

陳遠松(1992—)，男，貴州遵義人，主要研究方向為蔬菜栽培學(xué)。E-mail: 1291929934@qq.com

*通信作者，祝彪，E-mail: billzhu@zafu.edu.cn

S436

A

1004-1524(2017)08-1415-06

陳遠松，朱曉偉，龔翔宇，等. 分子標(biāo)記在我國番茄抗病育種的應(yīng)用研究進展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(8)： 1415-1420.