翹嘴鲌生長激素(GH)基因與側(cè)翼區(qū)的克隆及分析

劉士力，賈永義，蔣文枰，遲美麗，程 順，趙金良，顧志敏，*，傅建軍

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081)

翹嘴鲌生長激素(GH)基因與側(cè)翼區(qū)的克隆及分析

劉士力1，2，賈永義1，蔣文枰1，遲美麗1，程 順1，趙金良2，顧志敏1，*，傅建軍3

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081)

采用保守引物進行PCR成功擴增了編碼翹嘴鲌生長激素的基因，該基因全長5 966 bp，其中轉(zhuǎn)錄單元長1 648 bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。5′端和3′端側(cè)翼序列長度分別為2 282 bp和2 036 bp，分別包含 (AAT)8和(TTC)5T(TAA)8的微衛(wèi)星序列。上游區(qū)域包含TATA框，還有一些重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如Pit-1、Pit-1a、CREB、AP1、GR、HNF-3、HNF-3B等轉(zhuǎn)錄因子。翹嘴鲌的5個外顯子長度分別為64、140、117、162 和255 bp。推測的閱讀框為603 bp，編碼由22個氨基酸的信號肽和178個氨基酸成熟肽組成的多肽。在這個多肽中發(fā)現(xiàn)了5個保守的半胱氨酸殘基(Cys71、Cys135、 Cys173、Cys190和Cys198)和2個可能的N-糖基化位點(145th和197th)。翹嘴鲌GH氨基酸序列與團頭魴完全相同，與草魚只有一個氨基酸殘基的差異，構(gòu)建的魚類進化樹符合基本分類地位。翹嘴鲌生長激素基因4個內(nèi)含子長度分別為229、103、565 和103 bp。相對外顯子來說，種間內(nèi)含子變異較大，其中第三內(nèi)含子變異最大。該結(jié)果為進一步研究翹嘴鲌GH基因的表達、功能及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征奠定了分子基礎(chǔ)。

翹嘴鲌；生長激素基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

生長激素(growth hormone，GH)是由動物垂體前葉分泌的一種蛋白類激素，是影響動物生長性狀的主效基因[1]，不僅具有提高飼料轉(zhuǎn)化率[2]，促進肌肉中的蛋白質(zhì)合成[3]，加速魚類骨骼縱向生長[4]的重要作用，同時也參與了精子的發(fā)生和卵母細胞的成熟[5]。作為生產(chǎn)性能的候選基因，已經(jīng)有不少學(xué)者在豬、牛、雞等物種上做過研究，并發(fā)現(xiàn)了一些與重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的多態(tài)位點[6-8]。研究表明，GH基因編碼氨基酸序列高度保守，適合魚類高層分支進化的研究[9-10]。在GH基因啟動子區(qū)域也存在cAMP應(yīng)答元件(cAMP response element， CRE)和垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1 (pituitary-specific transcription factor-1， Pit-1)的結(jié)合位點。CRE含有回文序列TGACGTCA，或者TGACG模體[11-13]，可以與活化后的CRE結(jié)合蛋白(CRE-binding protein， CREB)結(jié)合[14]。CREB主要對cAMP等信號發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，通過自身磷酸化實現(xiàn)其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能。對于虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[15]啟動子的研究表明，其含有TGACG模體。草魚(Ctenopharyngodonidella)[16]中含有類似CRE的結(jié)構(gòu)(TGACC)，與虹鱒有1個堿基的差異，在莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[17]中還沒有明確的CRE，但它們均由cAMP調(diào)節(jié)。這表明不同魚類GH轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制是有差別的，具有較高的可變性。

Pit-1是垂體中一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對于垂體GH、PRL 和TSH 的合成具有重要的調(diào)節(jié)作用。對于虹鱒[15]、金頭鯛(Sparusaurata)[18]、草魚[16]和莫桑比克羅非魚[19]GH啟動子中Pit-1結(jié)合位點的研究表明其在脊椎動物中是保守的，其可能在生長激素轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵作用。莫桑比克羅非魚中cAMP對于GH表達的調(diào)節(jié)是Pit-1依賴的，當(dāng)離GH基因最近的Pit-1結(jié)合位點堿基發(fā)生突變時失去作用[17]。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星存在于數(shù)種魚GH基因的啟動子或內(nèi)含子中，包括尖吻鱸(Latescalcarifer)[20]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[21]和金頭鯛(Sparusaurata)[22]等。正是這些序列重復(fù)數(shù)目和長度的不同導(dǎo)致GH基因出現(xiàn)了復(fù)雜的多態(tài)性。當(dāng)串聯(lián)重復(fù)序列位于基因的調(diào)控區(qū)域時，他們可以直接影響其表達，從而影響引起這些基因數(shù)量性狀的變化[23]。此外，二核苷酸重復(fù)序列可以形成另外的DNA結(jié)構(gòu)，如Z-DNA[24]被證明是與多個基因的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。

翹嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)隸屬于鯉科(Cyprinida)、鲌亞科(Culterinae)、鲌屬(Culter)，是鲌亞科中體型最大的一種魚類，其肉白而細嫩，味美而不腥，具有重要的經(jīng)濟價值。翹嘴鲌又稱翹嘴紅鲌、白條魚、大白魚等，廣泛分布于中國各大水系[25]。此外，翹嘴鲌是以活魚為主食的兇猛肉食性魚類，對于維持淡水水域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用，具有良好的生態(tài)價值。近年來，翹嘴鲌養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，浙江省養(yǎng)殖面積已達到2 000 hm2以上。開展翹嘴鲌的育種具有重要的經(jīng)濟意義，采用分子標記技術(shù)為輔助手段可以提高育種效率。已有一些翹嘴鲌微衛(wèi)星引物已被開發(fā)[26-27]，但對于明確的重要功能基因中的遺傳標記的研究較少。本研究采用T-A克隆了翹嘴鲌GH基因全序列，通過對其核苷酸序列的比較分析，以期為翹嘴鲌人工選育奠定技術(shù)基礎(chǔ)，同時為鲌亞科魚類起源及進化機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用翹嘴鲌采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合實驗基地，剪取少量尾鰭，用無水乙醇于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：PCR 反應(yīng)試劑和pMD18-T 載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；膠回收試劑盒、大腸埃希菌 (Escherichiacoli) DH5α、氨芐和異丙基硫代半乳糖苷購自天根生化科技(北京)有限公司；用于DNA提取的試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1. 2 方法

1.2.1 DNA 提取

采用苯酚-氯仿法提取樣本DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，提取DNA原液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計

利用本實驗室獲得翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄組中GH的mRNA序列在GenBank中進行Blast比對，結(jié)果表明與團頭魴(AF463498)和草魚(X60419)的相似度較高，根據(jù)其保守區(qū)域設(shè)計7對特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系為25 μL: 10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs (各2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，模板DNA (50 ng·μL-1) 1.0 μL，上游、下游引物( 10 μmol ·L-1) 各0.5 μL，Taq聚合酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，滅菌超純水補足體系。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 克隆及測序

PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，如序列中包含微衛(wèi)星和Poly結(jié)構(gòu)導(dǎo)致測序不完整，克隆后再進行測序。

1.2.5 序列分析

利用軟件ContigExpress將所獲得的DNA片段和已知的mRNA序列拼接在一起；利用在線軟件Alibaba 2.1分析啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件。GH基因的mRNA及編碼的氨基酸序列按照劉士力等[28]的方法進行分析。內(nèi)含子的相似度通過GenBank的Blast功能計算。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星的查找分別通過SSRhunter 1.3和在線軟件Repfind進行。

表1 翹嘴鲌GH基因克隆PCR引物序列

Table 1 Primers used forGHgene cloning ofCulteralburnus

引物Primer序列(5'﹣3')Sequence(5'﹣3')產(chǎn)物長度Length/bp用途UsageP1F:CGGTAGACAGTCATCAGAATR:CCACAACCATCCAATCAATT6641-604P2F:GCTTCCATTCCGATTGTAACR:GTCGCACGGGTATATTTCTA139710-1406P3F:AATGAAGTCCTTAGCAATGCR:ATCACATCCATACCTCTAGC11461214-2359P4F:CTTAGTGCCAACAACATCATR:GCTCTTCTGTGTTTCATCTT12192107-3325P5F:GTTATCAAGGAGGACAACCTR:ATACAGCAGACACATTGGAT15883203-4790P6F:CTCCCATATCTAAACCCTACTTR:GCTGAATACACGACTCCTAA12914423-5713P7F:ACATCCTTCCAGAATCCTTCR:CAACCTACGCTACCATCTAA8685160-5966

2 結(jié)果與分析

2.1GH基因與5′側(cè)翼區(qū)的克隆、測序及鑒定

經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物的電泳條帶清晰，無雜帶，片段長度在800～2 000 bp，與對應(yīng)的目的序列十分接近，據(jù)此可初步確定獲得正確的目的片段。測序拼接獲得全序列5 966 bp。其堿基組成為：A+T 占47. 26% ，C+G 占52. 74%。

通過與GenBank中團頭魴(Megalobramaamblycephala)(登錄號：AF463498)和草魚GH基因的CDS序列(登錄號：AY157496)比對分析，相似度在90%以上，由此可以認為所獲得的序列為翹嘴鲌GH基因序列。將該序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號KX925976。

分析表明，該基因DNA序列中轉(zhuǎn)錄單元長1 648 bp，無微衛(wèi)星和小衛(wèi)星序列；5′端和3′端側(cè)翼序列長度分別為2 282 bp和2 036 bp，分別包含 (AAT)8和(TTC)5T(TAA)8的微衛(wèi)星序列。翹嘴鲌GH基因轉(zhuǎn)錄單元包含4個內(nèi)含子、5個外顯子。預(yù)測的內(nèi)含子均以GT開始，以AG 結(jié)束，符合真核生物外顯子與內(nèi)含子之間的剪接規(guī)律。其中4個內(nèi)含子大小分別為229、103、565和103 bp，5個外顯子長度分別為64、140、117、162和255 bp；mRNA序列全長為738 bp，5′-非翻譯區(qū)(5′ UTR)為54 bp，3′-非翻譯區(qū)(3′ UTR)為51 bp，開放閱讀框區(qū)(ORF)為633 bp，編碼由210個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)多肽。

2.2GH啟動子的分析

獲得的GH啟動子(圖1)，轉(zhuǎn)錄起始位點A在翻譯起始密碼子ATG上游54 bp。以轉(zhuǎn)錄起始位點A為+1位，-28～-23為TATA-box，此外還有2個TATA-box位于-147～-142和-310～-305。但在TATA盒附近沒有發(fā)現(xiàn)典型的CAAT盒。翹嘴鲌GH基因5端序列與團頭魴、草魚的相似度分別為94%和92%。Sun等[16]對于草魚生長激素基因啟動子的研究表明，其基本活性是由啟動子中-986至-742的序列維持，而黃體生成素受體的激活響應(yīng)序列位于-616至-572這一區(qū)域。通過將這一序列進行比對發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列完全相同。

AliBaba 2.1分析GH啟動子序列發(fā)現(xiàn)，GH啟動子含有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點，包括2個Pit-1、4個Pit-1a、2個CREB、5個AP1、8個GR、4個HNF-3、2個HNF-3B、1個SP1和1個MEF-2的結(jié)合位點。

2.3GH基因外顯子及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)比較

將鯉科7種魚類和鮰科斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的GH基因比較發(fā)現(xiàn)，露斯塔野鯪(Labeorohita)和斑點叉尾鮰由于第四外顯子長度和表2中所列的魚類不同，導(dǎo)致了編碼氨基酸長度的差異。表2中所列其他鯉科魚類編碼區(qū)序列長度均在603 bp左右，編碼210個氨基酸。

通過預(yù)測，翹嘴鲌GH蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為23.61 ku，理論等電點(isoelectric point，pI)為5.96，分子式C1038H1683N287O317S11。其中，亮氨酸(Lue)含量最高為10.7%。帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu) 66個，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys) 57個。脂肪族氨基酸指數(shù)為88.45。經(jīng)過蛋白質(zhì)序列分析，翹嘴鲌GH基因氨基酸預(yù)測無無跨膜結(jié)構(gòu)。翹嘴鲌生長激素成熟肽序列中包含由22個氨基酸組成的信號肽。在Asn155和Asn207位置上存在2個糖基化位點(天冬酰胺-天冬氨酸-絲氨酸和天冬酰胺-半胱氨酸-蘇氨酸)。

通過NCBI上的BLAST蛋白質(zhì)相似性分析，翹嘴鲌GH基因cDNA 序列與團頭魴編碼的氨基酸序列完全相同，而與草魚編碼的氨基酸序列只有一個氨基酸殘基差異，同源性分別為100%和99.5%。鯉科魚類GH氨基酸序列高度同源；翹嘴鲌和其他鯉科魚類一樣，均具有5個的半胱氨酸殘基(Cys71、Cys145、Cys183、Cys200、Cys208)，其中的4個半胱氨酸殘基非常保守，參與了二硫鍵(Cys71和Cys183，Cys200和Cys208)。它們對GH的正常折疊、維持空間結(jié)構(gòu)以及發(fā)揮生理功能有重要的作用。

2.4 翹嘴鲌GH氨基酸序列和其他物種的比較分析

利用MEGA5. 0 等軟件，對本研究獲得的翹嘴鲌GH 氨基酸序列及GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的團頭魴、草魚等15種魚類GH氨基酸序列，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹(圖3)。在NJ系統(tǒng)進化樹中，翹嘴鲌等鯉科魚類聚集在一起，然后與鮰科的斑點叉尾鮰聚成一支，露斯塔野鯪是鯉科中與翹嘴鲌關(guān)系最遠的魚類。除鰻鱺 (Anguillajaponica)單獨為一支外，其他用作參考的魚類聚成一支。該基因的系統(tǒng)進化關(guān)系與傳統(tǒng)的物種進化地位基本一致。

推測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點用單下劃線和陰影表示；轉(zhuǎn)錄起始位點用粗體加方框表示；翻譯起始密碼子ATG用粗體加雙下劃線表示Putative transcription factor binding sites are single-underlined and shaded; the transcription initiation site is in bold and boxed; the translation start codon ATG is in bold and double-underlined圖1 翹嘴鲌GH基因5′側(cè)翼區(qū)序列及部分潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測Fig.1 Sequence of the 5′-flanking region of the Culter alburnus GH gene and partial prediction of transcription factor binding sites

2.5GH基因內(nèi)含子的分析

相對于外顯子，GH基因內(nèi)含子存在相對較大的差異。雖然鯛科斑點叉尾鮰也包含4個內(nèi)含子，5個外顯子。但其4個內(nèi)含子均與翹嘴鲌沒有顯著的相似性，而且其第二和第四內(nèi)含子長度與翹嘴鲌相差懸殊。在目前已公布的序列中，團頭魴與翹嘴鲌最為相似，第一、二內(nèi)含子的相似度分別為88%和95%；第三、四內(nèi)含子完全一致。第一內(nèi)含子中主要差異在于存在2個缺失，長度分別為15 bp和9 bp。團頭魴、草魚、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)這三種魚和翹嘴鲌的內(nèi)含子長度較為接近，這三種魚的4個內(nèi)含子與翹嘴鲌的平均相似度分別為88%、87%、86%和92%。露斯塔野鯪，是鯉科中與翹嘴鲌差異較大的魚類，其第三內(nèi)含子的長度是翹嘴鲌的2.8倍左右，但Blast覆蓋度僅為12%。此外，在鯉科的這幾種魚類的內(nèi)含子中沒有發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星和小衛(wèi)星。

表2 翹嘴鲌與其他魚類GH基因外顯子和內(nèi)含子大小的對比

Table 2 Size comparison of the exon and intron ofGHgene amongCulteralburnusand other fish species

區(qū)域名稱Regionname翹嘴鲌Culteralburnus團頭魴Megalobramaamblycephala草魚Ctenopharyng-odonidella鰱Hypophthalmich-thysmolitrix丁鱥Tincatinca長頷須魚Gnathopogonelongates露斯塔野鯪Labeorohita斑點叉尾鮰IctaluruspunctatusKX925976AF463498X60419M94348HM114351FJ265030AF418921AF267989第一外顯子中編碼區(qū)CodingsequenceinexonⅠ1010101010101010第一內(nèi)含子IntronⅠ271247270270269218251229第二外顯子ExonⅡ140140140140140140140140第二內(nèi)含子IntronⅡ454456472471424455231113第三外顯子ExonⅢ117117117117117117117117第三內(nèi)含子IntronⅢ4374374474232963121248715第四外顯子ExonⅣ162162162162162162153132第四內(nèi)含子IntronⅣ136136148146137145141339第五外顯子中編碼區(qū)CodingsequenceinexonⅤ204204204204204204204204編碼區(qū)及內(nèi)含子Codingsequenceandintrons19311909197019431759176324951999

“*”表示完全保守的氨基酸位點；“:”表示不完全保守位點；“.”表示半保守位點；下劃線表示糖基化位點；半胱氨酸用黑框表示.Fully conserved residues are marked with an asterisk; incompletely conservative and semiconservative positions are marked with colons and periods respectively; N-glycosylation sites are underlined; Cys residues are boxed圖2 翹嘴鲌GH與其他魚類GH氨基酸序列比較Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of C. alburnus GH and GHs from other fish

圖中枝上的數(shù)據(jù)代表置信度，黑圓點是本研究得到的翹嘴鲌的GH氨基酸序列Numbers on nodes indicate bootstrap values. The amino acid sequence of C. alburnus GH is marked with a black dot圖3 基于GH基因氨基酸序列構(gòu)建的翹嘴鲌及其他魚類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of C. alburnus and other fish based on GH amino acid sequences

3 討論

生長激素基因是物種進化中相對保守的基因，目前對魚類GH基因序列研究發(fā)現(xiàn)，一部分魚類由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成[29-31]，一部分魚類包含6個外顯子和5個內(nèi)含子[22，32-33]，還有少部分魚類由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成[34-35]。現(xiàn)有的GH基因數(shù)據(jù)表明，鯉科中除了鳙魚(Aristichthysnobilis)和唐魚(Tanichthysalbonubes)外，其余魚類均屬于第一種。鳙魚和唐魚中第一外顯子編碼區(qū)長150 bp，對應(yīng)其他鯉科魚類第一外顯子編碼區(qū)和第二外顯子的長度之和。在對包含翹嘴鲌在內(nèi)的由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成的7 種鯉科魚類的GH基因序列結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，外顯子長度基本相同，內(nèi)含子大小存在一定程度的差異，露斯塔野鯪是鯉科中與翹嘴鲌差異較大的魚類，其第三內(nèi)含子的長度是翹嘴鲌的2.8倍左右。鯉科這7種魚類中除了親緣關(guān)系較遠的露斯塔野鯪[36]第四外顯子略有差異外，其余外顯子的長度完全一致。對于8 科15種魚類GH基因編碼區(qū)序列進行對比分析，鯉科魚類的GH基因編碼區(qū)序列同源性在89%～100%，與其他不同科的魚類序列同源性在65%～82%，這表明同一科魚類之間，生長激素基因編碼區(qū)序列具有相對較高的同源性，不同科魚類的生長激素基因序列的同源性明顯下降。

GH基因的多態(tài)性主要集中在內(nèi)含子中，如Almuly等[37]發(fā)現(xiàn)金頭鯛GH基因非編碼區(qū)內(nèi)存在小衛(wèi)星和微衛(wèi)星[18]的重復(fù)序列，對于內(nèi)含子1中小衛(wèi)星saGHFIM的研究表明具有長內(nèi)含子的片段會抑制GH基因表達的活性。魯雙慶等[32]在鱖屬(Siniperca)三種魚GH第二內(nèi)含子中的相同位置均發(fā)現(xiàn)了“AG”微衛(wèi)星序列。翹嘴鲌GH基因5′端序列也比較保守，與團頭魴和草魚的相似度分別為94%和92%。還有兩個關(guān)鍵區(qū)域序列與草魚完全一致[16]。雖然在翹嘴鲌內(nèi)含子中未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星和小衛(wèi)星。但在5端啟動子中發(fā)現(xiàn)了(AAT)8微衛(wèi)星序列。在同屬鯉科的團頭魴中也發(fā)現(xiàn)了(AAT)11微衛(wèi)星序列。在鯛科中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，金頭鯛[18]中與第二個Pit-1的結(jié)合位點相鄰處存在(CA)n微衛(wèi)星序列，而且等位位點高達11個，極有可能會調(diào)節(jié)啟動子的活性，影響GH基因的表達從而與生長性狀關(guān)聯(lián)。在同屬鯛科的真鯛[38](Pagrusmajor)類似位置也發(fā)現(xiàn)了(CA)n微衛(wèi)星序列，但在對一個野生群體進行檢測時未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

翹嘴鲌與各物種在GH基因編碼區(qū)核苷酸序列上的差異表明，盡管翹嘴鲌與其他魚類在GH基因核苷酸水平上具有一定的保守性，但由于不同物種間起源、進化過程中的變化，導(dǎo)致它們在DNA 水平上產(chǎn)生差異，這為從分子水平上研究翹嘴鲌與其他魚類物種間的起源及進化關(guān)系等提供了理論基礎(chǔ)。雖然唐魚只有4個外顯子，但在GH氨基酸序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)進化樹中，其仍然與鯉科魚類聚集在一起。除了用于系統(tǒng)進化分析外，完善的翹嘴鲌GH基因序列為啟動子和內(nèi)含子功能的進一步研究打下了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Cloning and sequence analysis of growth hormone gene and its flanking region in topmouth culter (CulteralburnusBasilewsky)

LIU Shili1，2， JIA Yongyi1， JIANG Wenping1， CHI Meili1， CHENG Shun1， ZHAO Jinliang2， GU Zhimin1，*， FU Jianjun3

(1.AgricultureMinistryKeyLaboratoryofHealthyFreshwaterAquaculture/KeyLaboratoryofFreshwaterAquaticAnimalGeneticandBreedingofZhejiangProvince，ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries，Huzhou313001，China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China; 3.KeyLaboratoryofFreshwaterFisheriesandGermplasmResourcesUtilization，MinistryofAgriculture，F(xiàn)reshwaterFisheriesResearchCenter，ChineseAcademyofFisherySciences，Wuxi214081，China)

Using conserved primers and PCR， a gene encoding topmouth culter (CulteralburnusBasilewsky) growth hormone (CaGH) was amplified and sequenced. The gene spans 5 966 bp， including 2 282 bp of 5′- and 2 036 bp of 3′-flanking sequences and a 1.7-kb transcription unit comprised of five exons and five introns. (AAT)8and (TTC)5T(TAA)8microsatellite sequences were found in the 5′- and 3′-flanking regions， respectively. The upstream region contains TATA boxes， and binding sites of important transcription factors such as Pit-1， Pit-1a， CREB， AP1， GR， HNF-3， and HNF-3B. The five exons inCulteralburnuswere 64 bp， 140 bp， 117 bp， 162 bp and 255 bp in length， respectively. The complete coding sequence was 603 bp and encodes a protein with a 22 amino acid signal peptide and a 178 amino acid mature peptide. Five conserved Cys residues (Cys71， Cys135， Cys173， Cys190， and Cys198) and two possible sites of N-glycosylation (residues 145 and 197) were detected in the GH polypeptide. The amino acid sequence of GH inCulteralburnuswas identical to that inMegalobramaamblycephala， and only one amino acid residue differs fromCtenpharyngodonidellus. The phylogenetic relationships among the GH amino acid sequences in fish were in accord with traditional classification. The lengths of the four introns inCulteralburnusGHgene were 229 bp， 103 bp， 565 bp and 103 bp， respectively. The variation of the introns among species was greater than that of the exons， and the variation of the third intron is the highest. These results provided the molecular basis for study of function and transcriptional regulation of theGHgene inC.alburnus， as well as the temporal expression in different developmental stages and at various nutritional levels.

Culteralburnus; growth hormone gene; clone; sequence analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.08

2017-03-17

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(2012C12907-7, 2016C02055-1)

劉士力(1985—)，男，湖北洪湖人，博士研究生，主要從事水生動物遺傳育種研究。E-mail: liushili1212@126.com

*通信作者，顧志敏，E-mail: guzhimin2006@163.com

S96;Q349+.55

A

1004-1524(2017)08-1281-09

劉士力，賈永義，蔣文枰，等. 翹嘴鲌生長激素(GH)基因與側(cè)翼區(qū)的克隆及分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(8)： 1281-1289.