三陰性乳腺癌中c- myc蛋白的表達(dá)及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

楊莊青 李 梅 王建逵 楊曉娟 陳 蕓

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院乳腺外二科，云南 昆明 650118)

三陰性乳腺癌中c- myc蛋白的表達(dá)及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

楊莊青 李 梅1王建逵 楊曉娟 陳 蕓1

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院乳腺外二科，云南 昆明 650118)

目的 探討三陰性乳腺癌(TNBC)中c- myc蛋白的表達(dá)及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 選取60例TNBC患者(TNBC組)及60例同期非TNBC患者(非TNBC組)，另選取同期乳腺增生患者30例為對照組，比較三組乳腺組織中c- myc蛋白的表達(dá)情況。分析c- myc蛋白的陽性表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，采用無病生存期(DFS)分析患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況。結(jié)果 TNBC組乳腺組織中c- myc蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于非TNBC組及對照組，非TNBC組亦高于對照組(P<0.05)；c- myc的表達(dá)與TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的關(guān)系(P<0.05)。c- myc陽性表達(dá)者術(shù)后3年DFS的比例顯著低于c- myc陰性表達(dá)者(P<0.05)。結(jié)論 c- myc在TNBC患者中高表達(dá)，且和TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)，c- myc過度表達(dá)的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高，可能參與術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子過程。

c- myc蛋白；三陰性乳腺癌；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；無病生存期

三陰性乳腺癌(TNBC)是雌激素受體(ER)、人表皮生長因子受體(HER)- 2、孕激素受體(PR)均為陰性的一種特殊亞型乳腺癌，發(fā)病率占乳腺癌的15%～25%，具有生物學(xué)特性高危、預(yù)后差的特點(diǎn)〔1〕。研究表明〔2〕，TNBC比其他乳腺癌更快發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此TNBC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)成為臨床研究重點(diǎn)。c- myc是一種常見的原癌基因，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖，主要由擴(kuò)增以及染色體易位重排的方式激活，已被證實(shí)在乳腺癌等多種癌癥中都表現(xiàn)出異常的高表達(dá)。本研究旨在探討c- myc蛋白的表達(dá)及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取云南省腫瘤醫(yī)院2010年12月至2013年12月TNBC患者癌組織標(biāo)本60例為TNBC組，選擇同期非TNBC患者60例為非TNBC組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①ER、PR和HER- 2均為陰性；②患者均經(jīng)過病理診斷確診；③所有患者臨床資料完整且知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；②術(shù)前接受內(nèi)分泌治療者；③省外不方便隨訪者；④隨訪期間死于其他疾病者。年齡60～82〔平均(66.3±4.1)〕歲；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ期28例；組織學(xué)分級：Ⅰ+Ⅱ級39例，Ⅲ級21例；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌46例，非浸潤性導(dǎo)管癌14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有46例，無14例。非TNBC組年齡60～79〔平均(65.2±5.3)〕歲；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ期23例；組織學(xué)分級：Ⅰ+Ⅱ級35例，Ⅲ級25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有40例，無20例。兩組年齡、臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較無顯著差異(P>0.05)。另外選擇同期本院收治的乳腺增生患者乳腺組織30例作為對照組，年齡61～81〔平均(25.1±4.3)〕歲。三組年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人c- myc蛋白單克隆抗體、抗體稀釋液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、c- myc熒光原位雜交試劑盒及其他試劑均來源于福州邁新生物科技有限公司。

1.2.2 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)法 采用FISH檢測c- myc基因擴(kuò)增情況：①取10 ml組織細(xì)胞保存液，1 300 r/min離心10 min，去除上清后，滴入膠原酶B溶液3 ml，37℃水浴20 min，1 300 r/min離心10 min，行低滲處理，加入2 ml固定液，混勻后1 300 r/min離心10 min，重復(fù)滴加固定液后離心，待液體微渾濁后懸滴至載玻片，自然晾干。②在玻璃片上滴加探針混合液10 μl，蓋玻片覆蓋，置于鋁盒中75℃水浴5 min，后置于42℃環(huán)境內(nèi)16 h。③去除蓋玻片置于洗滌液中洗滌2 min，置于70%乙醇中洗滌3 min，復(fù)染后暗處放置20 min。④用熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 免疫組化 鏈霉菌抗生物素蛋白- 過氧化物酶鏈接(SP)法，①脫蠟和水化：開始脫蠟前組織芯片在室溫放置60 min后，連續(xù)采用二甲苯浸泡20 min，分2次，接著置于無水乙醇5 min，然后采用甲醛固定和石蠟包埋組織芯片，貼附于經(jīng)過玻片硅化試劑盒(APES)處理的防脫磨砂玻片，置于-70℃恒溫孵育器孵育2 h，之后進(jìn)行免疫組化學(xué)染色。②免疫組化學(xué)染色：提前配合好磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸抗原修復(fù)液、1%鹽酸酒精；將組織片放入3個裝有二甲苯溶液中分別浸泡15 min進(jìn)行脫蠟；再依次放入無水乙醇溶液中，浸泡5 min，依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸浸泡2 min，最后放入自來水、蒸餾水中清洗，完成水化過程；③抗原修復(fù)和封閉內(nèi)源性過氧化氫酶：將切片浸入1×檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱2 min，然后停止加熱讓切片自然冷卻；放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min、放入蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次、放入PBS的玻璃缸中，浸泡5 min。④抗體雜交：甩去PBS余液，將組織片平鋪在濕盒中，加正常山羊血清1滴20 μl，28℃放置20 min，甩干；加稀釋好的一抗1滴，置于濕盒4℃過夜，置于PBS的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5 min。生物素耦聯(lián)的二抗20～50 μl，放置濕盒，37℃放置20 min。⑤顯色：加鏈親和素- 辣根過氧化物酶20～50 μl，濕盒內(nèi)28℃放置5～20 min，甩干、置于PBS玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5 min，更換PBS，同法操作3次，甩干、滴加新鮮配制的DAB工作液100 μl(以覆蓋組織為宜)，放置觀察反應(yīng)部位呈現(xiàn)黃褐色時(3～5 min)，置裝有自來水玻璃缸中涮洗3次。⑥復(fù)染：置于蘇木精溶液中復(fù)染5 min，然后反復(fù)自來水沖洗水不變色，接著采用酸酒精分化2 s，反藍(lán)水洗2 min。⑦脫水、透片及封片：置入95%乙醇溶液，浸泡5 min，無水乙醇2次，每次5 min，再放入二甲苯的溶液中，浸泡5 min，滴加適當(dāng)中性樹膠，封片，晾干。

1.2.4 結(jié)果判定 采用盲法連續(xù)觀察2個高倍視野，計(jì)數(shù)200個細(xì)胞。c- myc蛋白陽性表達(dá)為胞核呈棕黃色顆粒，用半定量計(jì)分方法，將染色強(qiáng)度分為無色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)，將陽性細(xì)胞比例分為<5%(0分)、5%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例的評分相乘，定義0分為-、1～4分為+；5～8分為；9～12分為，+、、均為陽性〔3〕。

1.3 隨訪 TNBC患者均進(jìn)行門診或電話隨訪，隨訪時間3年以上，患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況用無病生存期(DFS)進(jìn)行反映，DFS即從手術(shù)時間到證實(shí)癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)，采用Kaplan- Meier法繪制生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺組織中c- myc蛋白陽性表達(dá)率比較 TNBC組(76.67%，-14例，+12例，20例，14例)、非TNBC組(43.33%，-34例，+12例，8例，6例)乳腺組織中c- myc蛋白陽性率顯著高于對照組(6.67%，-28例，+1例，1例，0例)，TNBC組高于非TNBC組(P<0.05)。

2.2 c- myc的表達(dá)與TNBC患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 c- myc陽性表達(dá)與TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 c- myc的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 c- myc陽性、陰性TNBC患者術(shù)后3年DFS比較 c- myc陽性表達(dá)者術(shù)后3年DFS的比例為54.42%，陰性表達(dá)者為85.71%，兩組比較有顯著差異(χ2=4.467，P=0.034)。見圖1。

圖1 c- myc陽性、陰性TNBC患者術(shù)后3年DFS分析

3 討 論

乳腺癌包括正常乳腺樣型、HER- 2過表達(dá)型、luminalA型、luminalB型、基底細(xì)胞樣乳癌(BLBC)等5個亞型，而TNBC在基因水平、免疫表型、臨床特征等多個方面都與BLBC表現(xiàn)出了高度相似性，二者存在緊密的聯(lián)系，71%～91%的TNBC可歸于BLBC，而80%的BLBC屬于TNBC〔4〕。BLBC的生物學(xué)行為比其他類型乳腺癌更惡劣，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)治療的療效一般，又缺乏內(nèi)分泌治療與靶向治療，無論處在何種分期均存在較高的侵襲性，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后比其他類型乳腺癌更差。陳洪流〔5〕報(bào)道，非TNBC患者的3年存活率可達(dá)到90.4%，而TNBC患者僅有76.2%。

c- myc是較早發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，位于人染色體8q24，是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，其在宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等中都表現(xiàn)出了基因擴(kuò)增、重排的情況〔6〕。c- myc在ER陰性的乳腺癌中往往更先發(fā)生擴(kuò)增與過度表達(dá)，擴(kuò)增率達(dá)30%左右，而且一般為組織學(xué)分級高，預(yù)后差。Chen等〔7〕研究表明，乳腺癌的c- myc基因擴(kuò)增率高于非典型增生，更高于良性增生，提示在c- myc基因過度表達(dá)參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程。謝靜靜等〔8〕研究顯示，TNBC乳腺組織中c- myc蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于非TNBC，這與本研究結(jié)果基本一致，說明TNBC與其他類型乳腺癌在分子標(biāo)志物表達(dá)水平上存在一定的特殊性，c- myc基因表達(dá)可作為尋找藥物靶點(diǎn)的突破口。

相關(guān)報(bào)道指出〔9〕，組織學(xué)分級Ⅲ級的TNBC患者出現(xiàn)c- myc陽性表達(dá)的概率是Ⅰ～Ⅱ級患者的3.1倍，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC患者是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的2.5倍，提示組織學(xué)分級越高或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則c- myc陽性表達(dá)越明顯。本研究結(jié)果顯示，c- myc的表達(dá)與TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。究其原因，c- myc主要以二聚體的形式存在，能對靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，能通過抑制生長抑制基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期的調(diào)控，當(dāng)c- myc表達(dá)增多時，可加速細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂和加速細(xì)胞凋亡。

生存曲線說明c- myc過度表達(dá)的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高，與Tanino等〔10〕研究結(jié)果一致，提示c- myc過度表達(dá)可能對術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。經(jīng)典wnt- β- Catenin信號通路中的任何信號分子正常與否都與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，研究表明，TNBC的發(fā)生與下游重要靶基因c- myc在這個通路中過度表達(dá)有一定的聯(lián)系，但目前尚未完全明確其中的作用機(jī)制〔11〕。

作為具有高危生物學(xué)行為及臨床病理特征、缺乏有效的治療靶點(diǎn)、預(yù)后差的一個乳腺癌亞型，TNBC的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及其中的分子生物學(xué)機(jī)制應(yīng)得到更多的研究，后期應(yīng)擴(kuò)大樣本量，延長隨訪時間，爭取盡早從基因表達(dá)的水平上為靶點(diǎn)治療提供新的思路。

1 張 毅,王 燕,王 偉,等.青年女性三陰性乳腺癌的臨床病理學(xué)特征及其影響預(yù)后的多因素分析〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014;14(11):2092- 9.

2 郭海峰,李鐵靈,孫治國,等.在三陰性乳腺癌組織中環(huán)氧合酶- 2、核因子- κB及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2016;33(4):942- 4.

3 余 峰,張霄蓓,張 晟,等.三陰性乳腺癌復(fù)發(fā)特征及危險(xiǎn)因素分析〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,2014;94(28):2180- 3.

4 張 宏,王 文,田 甜,等.Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016;37(4):574- 7.

5 陳洪流.三陰性乳腺癌患者的臨床特征及預(yù)后因素〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(23):5840- 1.

6 Schüler- Toprak S,H?ring J,Inwald EC,etal.Agonists and knockdown of estrogen receptor β differentially affect invasion of triple- negative breast cancer cells in vitro〔J〕.BMC Cancer,2016;16(1):951.

7 Chen B,Dai D,Tang H,etal.Pre- treatment serum alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase as prognostic factors in triple negative breast cancer〔J〕.J Cancer,2016;7(15):2309- 16.

8 謝靜靜,蘇永輝,姜永冬,等.ki67在三陰性乳腺癌中的臨床病理意義〔J〕.國際免疫學(xué)雜志,2016;39(3):218- 21.

9 方 明,康 樂,陳英杰,等.Smoothened、STAT3和MMP- 9在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國免疫學(xué)雜志,2014;30(6):821- 4,830.

10 Tanino H,Kosaka Y,Nishimiya H,etal.BRCAness and prognosis in triple- negative breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy〔J〕.PLoS One,2016;11(12):e0165721.

11 馬 濤,張君瑩,吳建中,等.miR- 342- 3p對三陰性乳腺癌化療敏感性的影響〔J〕.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014;39(5):488- 95.

〔2017- 01- 07修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2014NS021)

楊莊青(1974- )，女，碩士，副教授，主要從事乳腺腫瘤研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3789- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.065

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院病理科