吲哚菁綠金納米籠的制備及體外抗腫瘤活性研究Δ

俞燕娜，李方舟，朱 浩，沈園園（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

吲哚菁綠金納米籠的制備及體外抗腫瘤活性研究Δ

俞燕娜＊，李方舟，朱 浩，沈園園#（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

目的：制備吲哚菁綠金納米籠（ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM），研究其體外抗腫瘤活性。方法：使用多元醇還原法制備銀納米立方體（AgNC）作為模板，通過離子置換反應(yīng)制備金納米籠（AuNC）。對AuNC形貌、粒徑及近紅外（NIR）光熱性質(zhì)進行表征。使用有機溶劑揮發(fā)法制備裝載ICG、1-十四醇（PCM）、表面修飾生物素聚乙二醇巰基（Biotin-PEG-SH）的ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，檢測其粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、載藥量，考察其在37、40℃下180 min內(nèi)的體外累積釋放度（Q）。以耐阿霉素人乳腺癌細胞（MCF-7/ADR細胞）為研究對象，采用MTT法考察ICG、ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的抗腫瘤活性，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果：AuNC為立方體，粒徑為60 nm左右，具有良好的光熱性質(zhì)。ICG/Biotin-PEG-AuNCPCM的粒徑為（105±2.8）nm，PDI為0.261±0.02（n＝3）；載藥量為1.34×108g/molAuNC；37℃下Q180min約為10%，40℃下Q20min約為80%。ICG、ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM對MCF-7/ADR細胞的IC50分別為95.2、29.3、16.1 μg/mL。結(jié)論：成功制得ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，其對MCF-7/ADR細胞的抗腫瘤活性強于ICG。

金納米籠；吲哚菁綠；光熱性質(zhì)；抗腫瘤活性

光動力治療是一類利用光敏劑進行非入侵性腫瘤診斷和治療的新方法[1-2]，其機制主要是通過特定波長的激光照射光敏劑，激發(fā)其于周圍的氧分子進行能量/電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生具有細胞毒性的活性氧自由基，從而引起腫瘤細胞的凋亡及壞死。吲哚菁綠（ICG）是目前唯一被美國FDA認證的近紅外（NIR）染料[3-5]。有文獻報道ICG具有光動力學(xué)性質(zhì)，親水性的特征使其能很好地在生物體內(nèi)分布，且被強穿透力的NIR光激發(fā)后能產(chǎn)生活性氧，進而發(fā)揮光動力療效殺死腫瘤細胞[6-7]。因此，ICG被認為是十分有潛力的光敏劑之一。

金納米籠（AuNC）是一類新型的通過調(diào)控合成過程中氯金酸（HAuCl4）加入量，得到NIR區(qū)不同局域表面等離子共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）峰的納米載體[8-10]。其獨特的空心內(nèi)部及多孔壁特征能有效地封裝藥物，利用其光熱性質(zhì)，通過局部NIR光照，使AuNC周圍溫度升高，一方面高溫殺死腫瘤細胞，起到光熱治療的效果[11]，另一方面通過引入溫敏性相變材料從而控制藥物的釋放。1-十四醇（PCM）是常見的相變材料，其相變溫度為38～39℃，僅稍高于人體正常體溫，且無毒、無腐蝕性。因此，PCM可作為AuNC的“門衛(wèi)”，有效地控制藥物分子的釋放[12-14]。

本研究將ICG與PCM物理混合后共同封裝于AuNC內(nèi)，當(dāng)體系溫度低于PCM相變溫度時，ICG能穩(wěn)定地存在于AuNC內(nèi)部；通過808 nm NIR對體系進行照射，AuNC由于光熱效應(yīng)導(dǎo)致周圍溫度升高，當(dāng)溫度達到PCM相變溫度時，PCM從固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，從而使ICG從AuNC內(nèi)部釋放出來，發(fā)揮光動力治療，起到光熱/光動力聯(lián)合治療的效果。此外，在AuNC表面進行表面修飾生物素聚乙二醇巰基（Biotin-PEG-SH）修飾，可增加載體在水中的分散性，有效地靶向腫瘤細胞，增加藥物的抗腫瘤效果?，F(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容報道如下。

1 材料

1.1 儀器

HC-2066高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；JEM-2010透射電鏡（日本Jeol公司）；Zatasizer Nano S動態(tài)光散射儀（英國Malvern公司）；LE-LS-808-2000TFCA 808 nm高溫激光器、LENS-808CC-A5 808 nm光纖激光連接器（深圳歐立光電技術(shù)有限公司）；Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo公司）；BD LSRGortessa流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥品與試劑

硝酸銀（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（美國Sigma-Aldrich公司，批號：MKBX7704V、MKBN3006V）；硫化鈉九水合物（Na2S·9H2O）、PCM[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號：H1527014、B1502036]；HAuCl4·4H2O（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20160321）；ICG原料藥[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：8SHBJ-CG，純度：99%]；聚乙二醇巰基（PEG-SH）、Biotin-PEG-SH（重均分子量：2 000）（北京鍵凱科技股份有限公司，批號：H20150909、20160419BL02）；1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：1786043）；MTT、胰酶、胎牛血清（FBS）（上海索萊寶生物科技有限公司，批號：303H0510、20150623、140716）；活性氧檢測試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S0033）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADR細胞（中國科學(xué)院上海藥物研究所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 AuNC的制備

制備銀納米立方體（AgNC）作為模板。調(diào)節(jié)磁力攪拌油浴鍋的轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為150℃。移取6 mL乙二醇于25 mL反應(yīng)瓶中，預(yù)熱1 h后，在溶液中加入200 μL Na2S溶液，隨后加入3 mL PVP和1 mL AgNO3，繼續(xù)反應(yīng)15 min，觀察顏色由黃色變?yōu)榧t褐色繼而變?yōu)椴煌该鞯幕揖G色后停止反應(yīng)，冷卻至室溫（現(xiàn)用現(xiàn)配）。用丙酮（丙酮的體積為反應(yīng)液的1倍）沖洗反應(yīng)液并以6 800×g離心20 min分離，棄上清液。產(chǎn)物用超純水超聲重分散，重復(fù)洗滌3次，將終產(chǎn)物AgNC分散到4 mL超純水中，4℃下密封避光保存。通過AgNC與HAuCl4的置換反應(yīng)制備AuNC[8]：磁力攪拌下，取AgNC 100 μL加入到5 mL超純水溶液（含1 g/L PVP）中，加熱至微沸，10 min后，將0.1 mmol/L HAuCl4溶液用注射泵以0.75 mL/min的速率注入反應(yīng)液中，直至反應(yīng)液的紫外吸收峰位于800 nm為止。反應(yīng)液中加入NaCl至飽和，1 400× g離心30 min，所得沉淀用超純水超聲重分散，重復(fù)洗滌3次，將最終產(chǎn)物AuNC超聲分散于超純水中，4℃下密封避光保存。

2.2 AuNC的形貌

使用透射電鏡觀察AgNC和AuNC的形貌。AgNC和AuNC的透射電鏡圖見圖1。

圖1 AgNC和AuNC的透射電鏡圖（×900 000）Fig 1 Transmission electron micrograph of AgNC andAuNC（×900 000）

由圖1顯示，AgNC形貌均一、棱角分明，粒徑在50 nm左右。AuNC為立方體，粒徑稍大于AgNC，約為60 nm，可見明顯的中空結(jié)構(gòu)及孔洞，壁厚約為8 nm，孔徑約為6 nm。

2.3 AuNC的光熱性質(zhì)

取濃度為37.5 pmol/L的AuNC溶液200 μL于96孔板，分別用0.5、1.0、1.5 W/cm2功率的NIR對其光照，考察光熱性質(zhì)，記錄每分鐘AuNC溶液溫度的變化。不同功率NIR光照下AuNC溶液的溫度-時間曲線見圖2。

圖2 不同功率NIR光照下AuNC溶液的溫度-時間曲線Fig 2 Temperature-time curve of AuNC solution under different powers of NIR illumination

由圖2可知，光照功率越大，溶液溫度變化的速度越快。從照射開始至5 min時，溫度上升較快，此后溫度變化較小，基本達到平衡。當(dāng)光照功率為1.5 W/cm2時，照射10 min后，AuNC溶液的溫度達到40℃以上，超過PCM的相變溫度。

2.4 ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的制備

稱取10 mg PEG-SH混合物（PEG-SH與Biotin-PEGSH之比為4∶1）與10 mL AuNC（濃度約為1 nmol/L）在氮氣保護下，冰浴中攪拌反應(yīng)24 h，8 390×g離心10 min。取沉淀，5 mL超純水復(fù)溶，洗滌2次，除去未接上的PEG，得到Biotin-PEG-AuNC，4℃下密封避光保存。取制備的Biotin-PEG-AuNC 1 mL（濃度為1 nmol/L），8 390×g離心10 min，取沉淀用1 mL甲醇復(fù)溶，置于反應(yīng)瓶中，加入100 mg PCM，90℃油浴中加熱至融化；待溫度降至40℃加入1 mL ICG（2 g/L）的甲醇溶液，攪拌使其分散均勻，50℃下完全揮干甲醇。上述混合物于40℃油浴中繼續(xù)加熱2 h，加入1 mL熱水使混合物分為2相，一相為PCM/藥物的混合物，另一相為載有PCM/藥物的AuNC和水（由于AuNC表面的親水性，所以優(yōu)先提取出來）。PCM由于不溶于水很難擴散到水中，從而導(dǎo)致PCM/藥物仍然有效地保留在AuNC內(nèi)。最后，通過離心獲取ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，沉淀重新分散在1 mL超純水中，反復(fù)洗滌3次除去游離的藥物，終產(chǎn)物于4℃下密封避光保存。

2.5 ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的表征及載藥量測定

使用粒徑儀檢測AgNC和AuNC、Biotin-PEG-AuNC和ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM的粒徑變化。4種樣品的粒徑分布情況見圖3。

圖3 4種樣品的粒徑分布情況Fig 3 Distribution of particle sizes of 4 samples

由圖3可知，4種樣品中ICG/Biotin-PEG-AuNCPCM的粒徑最大，為（105±2.8）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.261±0.02（n＝3）。將ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM用甲醇溶解超聲后，完全釋放所裝載的藥物ICG，通過紫外分光光度計測定和回歸方程計算得到載藥量為1.34×108g/molAuNC。

2.6 體外釋藥行為考察

取0.5 mL ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM溶液，用PBS（pH 7.4）為釋放介質(zhì)稀釋至2.5 mL，于37、40℃恒溫水浴，100 r/min振蕩進行釋放試驗。分別于5、10、20、30、40、60、80、100、120、150、180 min離心取1 mL上清，并加入新鮮釋放介質(zhì)重懸。采用紫外分光光度計測定釋放液中ICG濃度，計算累積釋放度。37、40℃下ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM中ICG的釋放曲線見圖4。

圖4 37、40℃下ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM中ICG的釋放曲線Fig 4 Release curves of ICG in ICG/Biotin-PEGAuNC-PCM under 37，40℃

由圖4可知，37℃下，180 min后，ICG/Biotin-PEGAuNC-PCM中ICG的累積釋放度約為10%，說明絕大部分藥物仍封裝在AuNC內(nèi)部；40℃下，藥物迅速釋放，20 min后，ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM中ICG的累積釋放度約為80%，說明藥物大部分從AuNC中釋放出來了。由此提示，體外釋藥行為具有良好的溫度響應(yīng)性。結(jié)合AuNC的光致熱效應(yīng)，可以通過NIR照射使AuNC溶液溫度升高從而控制藥物釋放。

2.7 體外細胞毒性

MTT法測定ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM對MCF-7/ADR細胞的細胞毒性。將MCF-7/ADR細胞以5 000個/孔的密度接種于96孔板，培育過夜。分別將100 μL含有1～100μg/mL系列濃度的ICG、ICG/PEG-AuNCPCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM溶液加至細胞培養(yǎng)板孔中，作用8 h后，給予NIR（1.5 W/cm2）照射20 min，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液200 μL，繼續(xù)避光孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜溶液，搖床輕搖10 min使甲臜晶體充分溶解。用酶標儀測定570 nm波長處的光密度，計算細胞抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。3種樣品對MCF-7/ADR細胞的抑制率-質(zhì)量濃度曲線見圖5。

圖5 3種樣品對MCF-7/ADR細胞的抑制率-質(zhì)量濃度曲線Fig 5 Inhibition rate-mass concentration curves of 3 samples on MCF-7/ADR cells

由圖5可知，與ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG比較，ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM對MCF-7/ADR細胞的抑制率明顯增加，ICG、ICG/PEG-AuNC-PCM、ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM對MCF-7/ADR細胞的IC50分別為95.2、29.3、16.1 μg/mL。這表明ICG/Biotin-PEG-AuNCPCM通過Biotin修飾增加了靶向性，結(jié)合ICG的光動力治療與AuNC的光熱治療特性有效地增加了其對細胞的殺傷作用。

3 討論

筆者前期研究中，以水為空白對照，利用808 nm激光發(fā)射器，考察了1.25、2.5、5μg/mL的ICG溶液在1.5 W/cm2功率的NIR光照下4 min內(nèi)的溫度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著ICG質(zhì)量濃度的升高，溶液的溫度升高速度越快、增幅越大；光照第2～4分鐘范圍內(nèi)，各質(zhì)量濃度的ICG溶液溫度變化均較小，表明已達平臺期，說明ICG溶液溫度變化的過程是先快后慢。

筆者前期研究中，分別考察了有、無NIR光照下18.75～100 pmol/L Biotin-PEG-AuNC-PCM對MCF-7/ ADR細胞抑制率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無NIR光照下，各濃度的Biotin-PEG-AuNC-PCM對MCF-7/ADR細胞抑制率均小于10%，說明無NIR光照時，載體材料對于腫瘤細胞的毒性較小；在NIR照射下，Biotin-PEGAuNC-PCM的細胞毒性隨其濃度的增大而增加，說明Biotin-PEG-AuNC-PCM在NIR光照下，發(fā)揮了光熱治療的效果，對MCF-7/ADR細胞有一定細胞毒性。

綜上所述，筆者成功制備了以AuNC為納米載體、裝載光敏劑ICG和相變材料PCM的新型NIR刺激響應(yīng)的ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，其對MCF-7/ADR細胞的抗腫瘤活性強于ICG。

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Preparation of Indocyanine Green Gold Nanocages and Study on Its in vitro Antitumor Activity

YU Yanna，LI Fangzhou，ZHU Hao，SHEN Yuanyuan（School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

OBJECTIVE：To prepare the Indocyanine green gold nanocages（ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM），and study its antitumor activity.METHODS：Polyol reduction method was used to prepare silver nanometer cubes（AgNC）as template，ion exchange reaction was used to prepare gold nanocages（AuNC）to characterize its morphology，particle size，near infrared（NIR）light and heat properties.Organic solvent evaporation method was conducted to prepare the ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM loaded with ICG，1-tetradecanol（PCM），surface modification of biotin polyethylene glycol mercapto（Biotin-PEG-SH）.Its particle size，polydispersity index（PDI）and drug loading were detected，and in vitro cumulative release（Q）within 180 min under 37，40℃was investigated.Using adriamycin-resistant human breast cancer cells（MCF-7/ADR cells）as objects，MTT method was used to investigate the antitumor activities of ICG，ICG/PEG-AuNC-PCM and ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM，and half inhibitory concentration（IC50）was calculated.RESULTS：AuNC was cubic with particle size of about 60 nm and good light and heat properties.The particle size of ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM was（105±2.8）nm，PDI was 0.261±0.02（n＝3）.Drug loading was 1.34×108g/mol AuNC，Q180minwas about 10%under 37℃and Q20minwas about 80%under 40℃.IC50of ICG，ICG/PEG-AuNC-PCM and ICG/Biotin-PEG-AuNC-PCM on MCF-7/ADR cells was 95.2，29.3，16.1 μ g/mL，respectively.CONCLUSIONS：ICG/Biotin-PEGAuNC-PCM is successfully prepared，and the antitumor activity on MCF-7/ADR cells is stronger than ICG.

Gold nanocages；Indocyanine green；Light and heat property；Antitumor activity

R943

A

1001-0408（2017）22-3113-04

2017-03-20

2017-05-12）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81573352）

＊碩士研究生。研究方向：納米給藥體系研究。電話：021-34204793。E-mail：z3yn1991@163.com

#通信作者：高級工程師，碩士。研究方向：分子藥劑學(xué)和納米給藥體系。電話：021-34204793。E-mail：shenuanyuan@sjtu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.24