維吾爾藥木吒栓中石榴皮和石榴花水提取工藝的優(yōu)化Δ

田紅林，陳 良，孫 蕓，李建梅（.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 8002；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系，烏魯木齊 8000；.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 80049）

·民族醫(yī)藥·

維吾爾藥木吒栓中石榴皮和石榴花水提取工藝的優(yōu)化Δ

田紅林1＊，陳 良1，孫 蕓2#，李建梅3（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830012；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系，烏魯木齊 830001；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049）

目的：優(yōu)化維藥木吒栓中石榴花與石榴皮的水提取工藝。方法：以總鞣質(zhì)和鞣花酸含量為評價(jià)指標(biāo)，以提取時(shí)間、提取次數(shù)和溶劑用量為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化石榴花、石榴皮的水提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：石榴花與石榴皮中總鞣質(zhì)和鞣花酸的最優(yōu)提取工藝為將2味藥材用10倍量水回流提取3次，每次0.5 h；驗(yàn)證試驗(yàn)中3批藥材提取出的總鞣質(zhì)與鞣花酸平均含量分別為151.69、24.59 mg/g（RSD分別為1.15%、1.41%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行，可用于木吒栓中石榴花、石榴皮中總鞣質(zhì)和鞣花酸的提取。

木吒栓；石榴花；石榴皮；提取工藝；正交試驗(yàn)；總鞣質(zhì)；鞣花酸

維吾爾藥木吒栓來自新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)維吾爾醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，由石榴皮、石榴花等藥材組方而成，具有收斂、消炎等功效，多用于治療滴蟲感染、陰道炎等病癥。為提高其臨床應(yīng)用效果，本課題組對其制劑工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。在本文中，主要對方中君藥石榴皮和石榴花中的主要成分進(jìn)行提取工藝研究。由于石榴皮和石榴花中有效成分相近[1-3]，故以2種藥材中均富含的鞣花酸、沒食子酸等鞣質(zhì)類成分為主要活性成分指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化影響2種成分水提取效果的相關(guān)工藝條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)[4-7]。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，包括2489紫外檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；Cintra 20紫外-可見分光光度計(jì)（澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司）；SECURA124-1CN電子天平（瑞士賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SGT7200HBT超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

石榴皮、石榴花藥材均購自新疆參茸中維藥飲片有限公司[批號：2016040906、2015031029，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科艾尼瓦爾主任藥師鑒定為石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮和花]；沒食子酸對照品（批號：110831-200803，純度：90.1%）、鞣花酸對照品（批號：111959-201501，純度：92.6%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；干酪素（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20141030）；磷酸、甲酸均為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總鞣質(zhì)含量測定方法

[8-12]方法進(jìn)行測定。

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，置于50 mL棕色量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，制成每1 mL含0.048 9 mg沒食子酸的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取石榴皮與石榴花藥材粉末（過60目篩）各50.0 g，精密稱定，加水1 000 mL，回流提取1 h，過濾，濾液定容至1 000 mL。精密量取提取液2 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 樣品含量測定 （1）總酚：精密量取供試品溶液2 mL至25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，搖勻，再加水10 mL，搖勻，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min；同時(shí)設(shè)置空白對照。依法測定吸光度（A），計(jì)算含量，即得。（2）不被吸附的多酚：精密量取供試品溶液25 mL，加至裝有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置于30℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液；精密量取續(xù)濾液2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，照總酚測定中自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起制備樣品，依法測定A，計(jì)算含量，即得。

根據(jù)公式“鞣質(zhì)含量＝總酚含量－不被吸附的多酚含量”[8]，計(jì)算鞣質(zhì)含量。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑制備空白對照，在760 nm波長處測定A。以A為縱坐標(biāo)（y）、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝0.092 3x－0.008 1（r＝0.999 3，n＝3）。結(jié)果表明，沒食子酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.08～10.80 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液2.0 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定樣品A，連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD為0.52%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知總酚含量的提取液樣品6份，每份2.0 mL，精密量取，分別加入一定量沒食子酸對照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；測定樣品中總多酚的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果總酚的平均加樣回收率為97.27%（RSD＝2.19%，n＝6），表明總酚含量測定方法的回收率良好，準(zhǔn)確度滿足要求。

2.2 鞣花酸含量測定方法

參考文獻(xiàn)[13-15]方法進(jìn)行測定。

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為菲羅門Fusion C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（23∶77），流速為1 mL/min；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。取“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果各主峰與相鄰峰的分離度均大于1.7，理論板數(shù)按鞣花酸計(jì)均大于5 600。

2.2.2 鞣花酸對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)40℃減壓干燥4 h的鞣花酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度0.176 mg/mL的鞣花酸對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液2 mL至10 mL棕色量瓶中，加甲醇5 mL，密塞，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz，下同）15 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取鞣花酸對照品溶液（0.176 mg/mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL，分別注入色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x）、對照品峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝2 028 601.46x+ 21 379.33（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，鞣花酸進(jìn)樣量在0.176～1.056 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下鞣花酸對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鞣花酸峰面積的RSD為0.89%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鞣花酸峰面積的RSD為1.92%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果，鞣花酸含量的RSD為1.57%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法測定回收率。精密量取同一供試品溶液6份，每份1.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.176 mg/mL的鞣花酸對照品溶液1.0 mL；加甲醇5 mL，超聲處理30 min，定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，鞣花酸的平均加樣回收率為99.35%（RSD＝1.72%，n＝6），表明鞣花酸含量測定方法的回收率良好，準(zhǔn)確度滿足要求。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提供工藝

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，對影響石榴皮和石榴花藥材中有效成分提取效果的主要因素提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、加水量（C）進(jìn)行研究，因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factor and levels

精密稱取石榴皮和石榴花藥材粉末9份，每份各100.0 g，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以總鞣質(zhì)和鞣花酸含量的綜合評分為考察指標(biāo)（2種成分的權(quán)重系數(shù)各為0.5）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis results of variance

由表2直觀分析結(jié)果可知，各因素的影響大小分別為A＞C＞B，最優(yōu)水平為A3B3C3。方差分析結(jié)果表明，A、C因素有顯著性影響（P＜0.05），故選擇A3C3；B因素?zé)o顯著性影響（P＞0.05），故選擇節(jié)能水平即B1。綜合以上結(jié)果，最優(yōu)提取工藝為A3B1C3，即取石榴皮和石榴花藥材粗粉混合，加10倍量水，回流提取3次，每次0.5 h，提取液過濾后混合，備用。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別稱取石榴皮和石榴花藥材粗粉各100.0 g，混合，按確定的最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算含量。結(jié)果，總鞣質(zhì)含量分別為153.65、151.09、150.32 mg/g，鞣花酸含量分別為24.17、24.63、24.96 mg/g，總鞣質(zhì)與鞣花酸平均含量分別為151.69、24.59 mg/g，RSD分別為1.15%、1.41%（n＝3）。結(jié)果表明，優(yōu)化工藝合理、穩(wěn)定，具有良好的重現(xiàn)性和可操作性。

3 討論

木吒栓中君藥石榴皮與石榴花中均含有沒食子酸與鞣花酸等主要成分，皆具有抗炎、抗氧化的功效，而鞣質(zhì)類成分的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，針對沒食子酸與鞣花酸含量測定的研究報(bào)道多采用高效液相色譜法[13-15]。在2015年版《中國藥典》（一部）中，在保留原有總鞣質(zhì)的檢測項(xiàng)時(shí)，與舊版藥典相比新增了石榴皮中鞣花酸的含量測定項(xiàng)目。在本研究前期預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，石榴皮與石榴花中鞣花酸含量遠(yuǎn)高于沒食子酸含量，故本研究針對2味藥材的共有成分，分別以紫外分光光度法和高效液相色譜法對總鞣質(zhì)和鞣花酸含量分別進(jìn)行檢測，以通過多指標(biāo)綜合評定來優(yōu)化石榴皮和石榴花藥材的提取工藝，可以較全面地反映提取物有效成分的信息，符合維吾爾醫(yī)學(xué)的整體觀理論。

筆者在參照2015年版《中國藥典》（一部）有關(guān)要求與規(guī)定[4]，在對供試品進(jìn)行超聲提取時(shí)，對提取時(shí)間（15、30、45 min）進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇超聲提取15 min即可將鞣花酸提取完全，與《中國藥典》規(guī)定的40 min相比時(shí)間縮短。

本試驗(yàn)以總鞣質(zhì)和鞣花酸含量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了石榴皮與石榴花的水提取工藝，建立了操作簡便且穩(wěn)定、合理的提取工藝，為維藥木吒栓后續(xù)制備工藝的研究提供了參考依據(jù)。

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Optimization of the Water Extraction Technology of Punica granatum Peel and Flowers in Muzha Uighur Medicine Suppository

TIAN Honglin1，CHEN Liang1，SUN Yun2，LI Jianmei3（1.Dept.of Pharmacy，Affiliated TCM Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830012，China；2.Dept.TCM，Xinjiang Medical University Institute of TCM，Urumqi 830001，China；3.Key Laboratory of Uygur Medicine Formulation，Xinjiang Uygur Medicine Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830049，China）

OBJECTIVE：To optimize the water extraction technology of Punica granatum peel and flowers in Muzha suppository.METHODS：Using total tannin，ellagic acid contents as evaluation indexes，extration time，times，the amount of solvents as investigation factors，L9（34）orthogonal test was adopted to optimize the water extraction technology of P.granatum flowers and peel. And verification test was conducted.RESULTS：The optimal extraction technology of total tannin and ellagic acid in P.granatum peel and flowers was as follow as 10-fold water reflux extraction for 3 times with 2 herbs，0.5 h every time.The average content of total tannin and ellagic acid extracted from 3 batches of herbs was 151.69 mg/g（RSD＝1.15%，n＝3），24.59 mg/g（RSD＝1.41%，n＝3）in the verification test，respectively.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is stable，feasible，and can be used for extracting the total tannin and ellagic acid in P.granatum peel and flowers.

Muzha suppository；Punica granatum flowers；Punica granatum peel；Extraction technology；Orthogonal test；Total tannin；Ellagic acid

R284.2

A

1001-0408（2017）22-3099-03

2016-11-07

2017-02-16）

（編輯：劉 萍）

新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No.2016-03-05）

＊中藥師。研究方向：中藥藥理。E-mail：85762226@qq.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：中藥藥理。E-mail：hello0125@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.20