Ⅱ型膠原蛋白與弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型的建立

周夏娟 應(yīng)旭旻

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

Ⅱ型膠原蛋白與弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型的建立

周夏娟 應(yīng)旭旻1

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

目的 探討成功建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型及如何提高建模成功率。方法 選擇8周齡的雄性DBA/1J小鼠20只，隨機(jī)分為正常組(n=10),CIA實(shí)驗(yàn)組(n=10)，100 μg牛Ⅱ型膠原蛋白溶于完全弗氏佐劑，在尾根部皮下注射，第21天再次注射50～100 μg。免疫后觀察小鼠的關(guān)節(jié)改變，按小鼠關(guān)節(jié)疾病嚴(yán)重程度評(píng)分。結(jié)果 正常組均未發(fā)病，實(shí)驗(yàn)組約4 w后開始第一個(gè)足趾出現(xiàn)腫脹，第7周發(fā)病率為50%，平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)(MAI)為2.1，10 w后CIA小鼠模型的發(fā)病率為90%，MAI為7.1。結(jié)論 選擇近交系雄性的DBA/1J小鼠，且選擇小鼠尾根部皮下注射Ⅱ型膠原蛋白與弗氏佐劑相對(duì)發(fā)病率較高。

DBA/1J ；關(guān)節(jié)炎；Ⅱ型膠原蛋白

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型是一種由膠原誘導(dǎo)的免疫炎癥模型,為多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,在動(dòng)物模型中表現(xiàn)的紅腫熱痛的病理表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制與人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)類似。1980年Courtenay等〔1〕建立了小鼠CIA 模型,極大地推進(jìn)了RA發(fā)病機(jī)制和治療的研究。目前對(duì)RA的研究熱點(diǎn)在于免疫抑制方面發(fā)病過程中免疫細(xì)胞的相互作用和明確各個(gè)細(xì)胞分子或酶類在各個(gè)免疫環(huán)節(jié)中的精確作用。因此選擇具備合適易感性的品系、建立穩(wěn)定的CIA模型對(duì)研究RA的研究具有重要意義，本實(shí)驗(yàn)選用H- 2q單倍型的易感性最高的DBA/1J小鼠，應(yīng)用Ⅱ型膠原與弗氏佐劑混合誘導(dǎo)的方法，探討建立高效穩(wěn)定CIA小鼠模型的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 近交系DBA/1J小鼠20只，雄性,8周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)別飼養(yǎng)。隨機(jī)分配為正常組和實(shí)驗(yàn)組各10例。

1.2 主要試劑與器材 牛Ⅱ型膠原蛋白、完全弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；冰醋酸(杭州紅十字會(huì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；制冰機(jī)，5 ml空針；橡皮管。

1.3 方法

1.3.1 模型建立方法 牛Ⅱ型膠原蛋白溶于冰醋酸中，濃度為2 mg/ml，放置4℃冰箱中隔夜，等體積與完全弗氏佐劑混合。將2個(gè)5 ml的空針拔掉枕頭，兩針管間用橡皮管連接，將混合液在2個(gè)空針間反復(fù)來回推動(dòng)充分乳化。將乳化好的試劑在2 h以內(nèi)免疫小鼠，在尾根部皮下注射膠原100 μg/只。第21天后再次注射免疫50～100 μg/只，避免重復(fù)第一次注射部位。

1.3.2 觀察指標(biāo) 適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每?jī)商煊^察并記錄各小鼠足趾情況及體重變化，每周匯總并分析，持續(xù)14 w，其中12 w后實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡1只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組9只，正常組10只。

1.3.3 疾病發(fā)病和關(guān)節(jié)病變的評(píng)分 關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)(AS)：為每只小鼠所有病變關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和,最高分為16 分。各劑量組所有小鼠AS總和除以該組小鼠的只數(shù),即為該組平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)(MAI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

正常組為無(wú)發(fā)病小鼠。實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)4 w后開始首只小鼠足趾出現(xiàn)紅腫，第69天到達(dá)高峰。其腫脹多在趾間關(guān)節(jié)開始，隨后腫脹至足墊，踝關(guān)節(jié)，腫脹后可發(fā)展為關(guān)節(jié)僵硬、畸形，前后趾發(fā)病前后不一，前趾的發(fā)病率為70%，后趾的發(fā)病率為80%。小鼠足趾腫脹程度見圖1。第7周實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率為50%，MAI為2.1；10 w后實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率為90%，MAI為7.1。實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫10 w腫脹程度達(dá)峰值，且10 w后腫脹程度稍有減少，但仍維持在較高水平。免疫100 d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重均值〔(24.36±1.37)g〕,明顯低于正常組〔(27.25±1.38)g，t=4.701，P<0.05〕，表明膠原免疫致病對(duì)小鼠的體重變化有影響。

圖1 DBA/1J小鼠關(guān)節(jié)病變

3 討 論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前常用的RA動(dòng)物模型有佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型、CIA模型和人鼠嵌合模型〔2，3〕，但人鼠嵌合模型雖然在機(jī)制方面有明顯優(yōu)勢(shì)，但受倫理、法制等約束故臨床不常用，故本研究選擇更接近RA發(fā)病機(jī)制的CIA模型。本文結(jié)果顯示牛Ⅱ型膠原蛋白免疫的DBA/1J小鼠發(fā)病率高可達(dá)90%以上，且MAI和發(fā)病嚴(yán)重程度均較高，能夠?yàn)镽A的發(fā)病機(jī)制和病理特征的研究提供穩(wěn)定的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)研究實(shí)驗(yàn)大鼠作為動(dòng)物模型，大鼠的CIA模型動(dòng)物品系有DA大鼠、SD和Wistar遠(yuǎn)交群大鼠、近交系Lewis大鼠，其中DA大鼠主要由國(guó)外引進(jìn)，價(jià)格昂貴、適應(yīng)力差、免疫力低下，不易哺育等特點(diǎn)限制了其實(shí)際應(yīng)用；遠(yuǎn)交群SD和Wistar大鼠價(jià)格便宜、適應(yīng)力強(qiáng)，繁殖快等特點(diǎn)為國(guó)內(nèi)研究建造CIA模型高頻率應(yīng)用；近交系Lewis大鼠因購(gòu)買方便，價(jià)格合理是國(guó)內(nèi)使用率相對(duì)較高的品系〔4〕。小鼠CIA敏感性和老鼠的組織相容性復(fù)合體(MHC)相關(guān)，因此只有選擇易感性強(qiáng)的H- 2q或H- 2r單倍型的小鼠如：DBA/1 (H- 2q) B10.RIII (H- 2r)和易感性稍弱的C57BL/6小鼠。在大鼠中對(duì)CIA的敏感性也與組織相容性復(fù)合體相關(guān)，但與小鼠相比較具有比較寬的范圍，因此本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠作為動(dòng)物模型。目前小鼠CIA模型的品系大致分為兩種易感性強(qiáng)的DBA/1 (H- 2q)或B10.RIII (H- 2r)和易感性較弱的C57BL/6(H- 2b)小鼠，對(duì)有文獻(xiàn)報(bào)道C57BL/6小鼠CIA模型的發(fā)病率最高為70%〔5〕,明顯低于DBA/1J品系的小鼠(發(fā)病率90%～100%)。不同品系的小鼠對(duì)不同種類的Ⅱ型膠原蛋白的敏感度是不同的，如B10.RIII小鼠對(duì)牛型、豬型的Ⅱ型膠原蛋白敏感，但是對(duì)雞型和人型的Ⅱ型膠原蛋白無(wú)反應(yīng)。DBA/1J小鼠對(duì)雞型、牛型、豬型、人型都具有高敏性，故本實(shí)驗(yàn)選擇牛Ⅱ型膠原蛋白。試劑在乳化過程的充分性也至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)用橡皮管連接的兩個(gè)空針作為乳化的工具，將等體積溶于完全弗氏佐劑中的膠原蛋白在冰浴環(huán)境中來回推動(dòng)乳化，乳化時(shí)間至少2～3 h才能將其充分乳化。但此種乳化耗時(shí)久，過程中試劑耗損大，推薦使用勻漿器充分乳化。

1 Courtenay JS,Dallman MJ,Dayan AD,etal.Immunisation against heterologous type Ⅱ collagen induces arthritis in mice〔J〕.Nature,1980;283(5438):666- 8.

2 張 巍,王 芳,王 博,等.佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離〔J〕.中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)報(bào),2012;20(6):73- 7.

3 孫佳蕾,武 平,陳白露,等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型在中醫(yī)研究中的應(yīng)用〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015;24(4):444- 7.

4 趙宏艷,王 燕,肖 誠(chéng),等.不同品系、不同性別對(duì)大鼠CIA發(fā)病情況的比較研究〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)雜志,2010;16(9):761- 4.

5 賈俊峰,李曉燕,朱 平,等.C57BL/ 6小鼠CIA模型的建立及其監(jiān)測(cè)體系的初步篩選〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2004;29(6):472- 4.

〔2016- 01- 13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

杭州市科技局項(xiàng)目(No.20110733Q15)

應(yīng)旭旻(1972- )，男，博士，主任中醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腎臟病學(xué)研究。

周夏娟(1988- )，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治腎臟疾病研究。

R392

A

1005- 9202(2017)15- 3689- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.020

1 杭州市急救中心