間充質(zhì)干細(xì)胞緩解大鼠急性肺損傷的分子機(jī)制

胡曉旻 劉 剛 劉 超 王延安

(天津市第三中心醫(yī)院心臟中心，天津 300170)

間充質(zhì)干細(xì)胞緩解大鼠急性肺損傷的分子機(jī)制

胡曉旻 劉 剛1劉 超2王延安3

(天津市第三中心醫(yī)院心臟中心，天津 300170)

目的 探討間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)抑制核因子(NF)- κB的活性和抑制親環(huán)素(CyP)A的表達(dá)而緩解急性肺損傷(ALI)的分子機(jī)制。方法 首先比較臍帶和骨髓MSCs的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型、分化能力和免疫能力，并采用全基因組表達(dá)芯片比較兩者的功能基因表達(dá)差異。通過(guò)注射脂多糖(LPS)制備SD大鼠ALI模型，研究輸注MSCs能否通過(guò)抑制CyPA的表達(dá)和抑制NF- κB的活性，進(jìn)而控制炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活和抑制氧化應(yīng)激等，減輕內(nèi)毒素所致的ALI。 結(jié)果 CD29在臍帶MSCs的陽(yáng)性表達(dá)率低于在骨髓MSCs中的表達(dá)率(P<0.01)。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的MSCs中高表達(dá)的基因主要集中在免疫相關(guān)和骨骼發(fā)育相關(guān)的基因，而臍帶MSCs中高表達(dá)的基因主要集中在細(xì)胞分化、器官發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因。對(duì)SD大鼠ALI損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs干預(yù)可減輕LPS對(duì)肺組織的損傷程度。LPS組各時(shí)間點(diǎn)血漿促炎因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)- 2 水平顯著高于對(duì)照組和MSCs+LPS組(P<0.05)。MSCs可顯著抑制LPS誘發(fā)的炎癥因子MIP- 2的增高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，LPS組在各時(shí)間點(diǎn)CyPA蛋白表達(dá)和TNF- α表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而MSCs可以抑制CyPA的蛋白和TNF- α的表達(dá)(P<0.05)。肺組織NF- κB 在LPS組增高，MSC干預(yù)可有效降低NF- κB 表達(dá)(P均<0.05)。LPS組肺組織丙二醛(MDA)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性水平在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組，在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，MSCs+LPS組肺組織MDA和MPO均明顯低于LPS組(P均<0.05)。結(jié)論 臍帶MSCs明顯降低了大鼠血漿促炎因子的水平，可顯著抑制CyPA的表達(dá)，并通過(guò)抑制NF- κB的活性減輕了LPS引起的全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕了LPS所致的肺損傷。

間充質(zhì)干細(xì)胞；急性肺損傷；核因子- κB；親環(huán)素A；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

急性肺損傷(ALI)發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明，目前臨床上ALI的治療主要是支持性治療，尚未找到針對(duì)性的治療措施。存在于革蘭陰性菌表面的脂多糖(LPS)可以通過(guò)Toll樣受體(TLR)4激活下游的核因子(NF)- κB信號(hào)通路〔1,2〕。NF- κB信號(hào)通路活化后，啟動(dòng)靶基因的表達(dá)，可以引起腫瘤壞死因子(TNF)- α、白細(xì)胞介素(IL)- 1、IL- 6、IL- 8等多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。親環(huán)素(CyP)A在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，生理功能為對(duì)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化刺激，而且在細(xì)胞外部對(duì)白細(xì)胞具有趨化作用。CyPA通過(guò)與受體CD147結(jié)合，可以活化NF- κB通路〔3〕，因此在病理情況下具有促炎作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有多向分化、免疫調(diào)節(jié)的特性，不僅能夠歸巢至損傷組織，抑制受損組織發(fā)生的免疫反應(yīng)和過(guò)度炎性反應(yīng)，MSCs還具有向多種組織、細(xì)胞分化的潛能，因此在創(chuàng)傷修復(fù)、組織功能再生與重建、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊〔4〕。MSCs可通過(guò)其抗炎、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)的作用，減輕內(nèi)毒素引起的ALI，改善肺功能，提高ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模式動(dòng)物的生存率，為ALI的治療提供了新的方法與思路。本研究探討抑制NF- κB的活性和CyPA的表達(dá)而緩解ALI的分子機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 材料與試劑 臍帶MSCs的獲?。翰杉阍陆】敌律鷥耗殠ЫM織30份。足月正常分娩之臍帶來(lái)自我院產(chǎn)科病房，均取得產(chǎn)婦及家屬的知情同意。產(chǎn)婦的年齡為(29.1±5.7)歲。骨髓MSCs的獲?。撼Ｒ?guī)局麻，于髂骨取骨髓，分離制備骨髓MSCs。低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清和Trizol試劑購(gòu)自Gibco公司。熒光標(biāo)記鼠抗人CD29、CD44、CD73、CD105和CD166及其同型對(duì)照購(gòu)自Sigma公司。

1.2 MSCs的培養(yǎng)和鑒定 臍帶MSCs采用胰酶消化法獲取。取無(wú)菌臍帶2 cm，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈，剪碎后使用Ⅳ型膠原酶37℃消化，離心，洗滌3遍，取下層沉淀，再以胰蛋白酶PBS消化后離心，獲取沉淀后使用吹打細(xì)胞懸浮，以100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾并離心獲得單細(xì)胞。然后以PBS離心后洗滌細(xì)胞2次，置于低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。骨髓組織用PBS液稀釋后，放置在淋巴細(xì)胞分離液面上，離心25 min后獲得單個(gè)核細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。另種MSCs均傳至F4代時(shí)進(jìn)行常規(guī)倒置顯微鏡觀察，進(jìn)行HE染色。在含MSCs的PBS中加入鼠抗人抗體PE- CD44，F(xiàn)IFC- CD29,PE- CD73，F(xiàn)IFC- CD90，PE- CD105,PE- CD166，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.3 利用基因芯片分析MSCs的基因表達(dá) 使用人全基因組表達(dá)基因芯片對(duì)這兩種細(xì)胞的基因組表達(dá)和微小表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，并對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析。采用Affymetrix mrcroarray 公司提供的基因差異表達(dá)芯片，生物素標(biāo)記cDNA，進(jìn)行雜交反應(yīng)，采用基因芯片操作軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和處理，使用DAVID分析軟件進(jìn)行功能聚類(lèi)分析。

1.4 膿毒癥ALI模型的制作及輸注MSCs懸液治療肺損傷 選擇SD大鼠90只，隨機(jī)分成3組，分別為對(duì)照組30只、LPS組30只和MSC+LPS組30只。LPS組和MSC+LPS組均采用腹腔內(nèi)注射LPS 10 mg/kg的方法制作膿毒癥模型，后者于LPS注射1 h后，通過(guò)鼠尾靜脈給予含5×105臍帶MSCs的生理鹽水300 μl，對(duì)照組和LPS組則給予300 μl生理鹽水。分別于尾靜脈注射后6 h、24 h和48 h處死大鼠，每次10只，于左肺取得支氣管肺泡灌洗液，測(cè)定支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度，收集血漿和右肺組織。取右肺下葉，采用4%多聚甲醛溶液對(duì)SD大鼠肺臟進(jìn)行固定，常規(guī)病理切片后進(jìn)行HE染色。以肺泡充血、出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡間隔增厚或透明膜形成等四種病變對(duì)肺組織損傷進(jìn)行綜合評(píng)定并分級(jí)。0級(jí)為無(wú)損傷，1級(jí)肺組織損傷面積小于1/4，2級(jí)肺組織損傷面積介于1/4～1/2，3級(jí)肺組織損傷面積介于1/2～3/4，4級(jí)肺組織損傷面積大于3/4。取右肺中葉，制備肺組織勻漿。將各組肺組織勻漿100 mg，ELISA方法測(cè)定肺組織TNF- α水平，免疫熒光法測(cè)定肺組織CyPA蛋白含量，并測(cè)定CyPA mRNA表達(dá)水平。取右肺上葉，先稱(chēng)重，然后進(jìn)行烘干并再次稱(chēng)重，計(jì)算肺組織濕干比。采用ELISA的方法測(cè)定炎癥因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)- 2、IL- 10、CyPA和NF- κB水平。采用Western印跡方法測(cè)定NF- κB的肺組織入核水平。對(duì)肺組織丙二醛(MDA)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩種MSCs細(xì)胞表面抗原表達(dá) 臍帶來(lái)源的MSCs細(xì)胞表面CD44、CD73、CD90、CD105和CD166陽(yáng)性表達(dá)率分別為(92.15±4.31)%、(94.43±3.68)%、(97.39±4.74)%、(93.88±5.11)%和(98.62±4.64)%，骨髓來(lái)源的MSCs細(xì)胞表面CD44、CD73、CD90、CD105和CD166陽(yáng)性表達(dá)率分別為(92.78±4.22)%、(95.02±3.49)%、(96.86±4.45)%、(93.23±4.98)%和(98.23±4.14)%，兩組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是CD29在臍帶MSCs的陽(yáng)性表達(dá)率僅(43.5±2.32)%，明顯低于在骨髓MSCs中的表達(dá)率(90.15±3.43)%(P<0.01)。

2.2 基因芯片分析MSCs的基因表達(dá) 基因芯片mRNA差異表達(dá)分析臍帶來(lái)源MSCs和骨髓來(lái)源MSCs之間至少4倍差異表達(dá)的基因，可得到1 190個(gè)差異表達(dá)的基因。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的MSCs中高表達(dá)的基因主要集中在免疫相關(guān)和骨骼發(fā)育相關(guān)的基因，而臍帶MSC中高表達(dá)的基因主要集中在細(xì)胞分化、器官發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因。

2.3 SD大鼠肺組織病理、肺組織濕干比、支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度改變 SD大鼠于腹腔注射LPS 6 h開(kāi)始，肺組織病理開(kāi)始肺毛細(xì)血管充血、出血，肺毛細(xì)血管、肺泡間隔和肺泡腔可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡內(nèi)可見(jiàn)富含蛋白質(zhì)的水腫液，于LPS注射24 h時(shí)達(dá)到高峰，48 h水腫液開(kāi)始減少。MSC+LPS組肺組織的損傷程度于6 h、24 h和48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較LPS組明顯減輕。LPS組24 h肺組織濕干比明顯升高并達(dá)峰，MSC+LPS組24 h肺干濕比明顯低于LPS組(P<0.05)，48 h MSC+LPS組和LPS比較，肺組織濕干比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度在LPS組明顯增高升高，并于24 h達(dá)到高峰。與LPS組比較，MSC+LPS組在各時(shí)間點(diǎn)支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)血漿MIP- 2、IL- 10 水平的組間比較 LPS組在時(shí)間點(diǎn)血漿促炎因子MIP- 2 水平顯著高于對(duì)照組和MSC+LPS組(P<0.05)；血清IL- 10 水平組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MIP- 2水平在LPS刺激下明顯升高并于6 h達(dá)峰。MSC+LPS組各時(shí)間點(diǎn)MIP- 2水平顯著低于LPS組，說(shuō)明MSCs可顯著抑制LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。見(jiàn)表1。

2.5 肺組織CyPA、TNF- α 水平的組間比較 與對(duì)照組相比，LPS組在6 h、12 h和24 h CyPA蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，與LPS組相比，MSC+LPS組CyPA表達(dá)下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明LPS可以明顯提高SD大鼠肺組織的CyPA的表達(dá)，而MSCs可以抑制CyPA的蛋白表達(dá)。LPS組肺組織TNF- α表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組的表達(dá)水平(P<0.05),各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)MSC+LPS組TNF- α表達(dá)水平均低于LPS組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6 肺組織NF- κB(P65)入核檢測(cè)結(jié)果的比較 肺組織NF- κB在對(duì)照組、LPS組和MSC+LPS組NF- κB 表達(dá)分別為(0.25±0.04)、(0.69±0.04)和(0.42±0.04)，三組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.7 肺組織MDA和MPO活性水平比較 LPS組肺組織MDA在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，MSC+LPS組肺組織MDA水平則明顯低于LPS組(P<0.05)。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)LPS組MPO活性水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；MSC+LPS組明顯低于LPS組(P<0.05)；各組內(nèi)MPO水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組血漿MIP- 2、IL- 10水平比較

與LPS 組比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05，下表同

表2 不同時(shí)間點(diǎn)肺組織CyPA、TNF- α 水平的比較

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織MDA和MPO活性水平比較

3 討 論

膿毒癥所致的ALI發(fā)病具體機(jī)制目前尚未完全明確。一過(guò)性的炎癥反應(yīng)是機(jī)體控制感染的自我保護(hù)反應(yīng)，目前普遍認(rèn)為ALI發(fā)病的本質(zhì)是大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子導(dǎo)致的過(guò)度失控性的炎性反應(yīng)。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素作用下，產(chǎn)生TNF- α、白細(xì)胞介素等促炎因子，啟動(dòng)炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔5〕。因此內(nèi)毒素血癥是ALI/ARDS發(fā)病的始動(dòng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)活化各種炎癥細(xì)胞，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肺血管通透性增高、肺泡腔蛋白質(zhì)滲出、肺水腫和透明膜的形成。

既往研究表明，LPS可以TLR4激活下游的NF- κB信號(hào)通路〔6〕。NF- κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與B細(xì)胞免疫球蛋白的輕鏈κ鏈基因增強(qiáng)子序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，引起包括MIP- 2、TNF- α和IL家族在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，從而誘發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，因此NF- κB通路在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程中起核心作用〔2,6〕。因此阻斷NF- κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可減輕LPS誘導(dǎo)的ALI的炎癥反應(yīng)，因此有望成為治療ALI/ARDS的靶點(diǎn)。MSCs可以從骨髓、臍帶、脂肪、肝臟等臟器或組織獲得，然而不同組織取得的MSCs在功能和分化上不盡相同。本研究結(jié)果證實(shí)臍帶來(lái)源的MSCs具有更高的增殖率，骨髓來(lái)源的MSCs中高表達(dá)的基因主要集中在免疫相關(guān)和骨骼發(fā)育相關(guān)的基因，而臍帶MSCs中高表達(dá)的基因主要集中在細(xì)胞分化、器官發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因。對(duì)于盲腸結(jié)扎穿孔的膿毒癥小鼠模型的研究表明受累的肺組織中MIP- 2 表達(dá)及MPO 均明顯增高〔7〕。本研究說(shuō)明MSCs干預(yù)可明顯減輕大鼠肺損傷。

炎癥因子會(huì)進(jìn)一步活化中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，趨化中性粒細(xì)胞遷移到肺組織內(nèi)。中性粒細(xì)胞激活后產(chǎn)生氧自由基和蛋白酶，中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，可直接損傷肺組織或通過(guò)激活誘導(dǎo)炎癥因子釋放，引發(fā)炎癥逐級(jí)放大〔8〕。MPO可反映中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度〔9〕，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物〔10〕。本研究說(shuō)明MSCs干預(yù)可阻斷或部分阻斷中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和呼吸爆發(fā)。

CyPA 主要由活性氧化物質(zhì)的激活分泌，通過(guò)與受體CD147結(jié)合激活NF- κB 通路，調(diào)節(jié)促炎因子TNF- α等的釋放〔3,11〕。NF- κB以p65/p50二聚體的形式存在于胞質(zhì)中，其中p65含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域。靜息狀態(tài)下，胞質(zhì)中的NF- κB與IκB- α結(jié)合，使p65的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域功能受到抑制而不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用〔12〕。本研究說(shuō)明MSCs在NF- κB通路的上游起作用，從而干預(yù)caspase級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。

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〔2015- 12- 31修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

2015年中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015M581308)；天津市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目(11ZCGYSY02000)；天津市衛(wèi)生局重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(12KG106)

劉 剛(1972- )，男，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉、疼痛診療和緩和醫(yī)療研究。

胡曉旻(1974- )，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事心臟重癥治療與急救研究。

R563

A

1005- 9202(2017)15- 3664- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.010

1 北京軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科 2 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科

3 河北省巨鹿縣醫(yī)院麻醉科