苯那普利對糖尿病腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子表達的調(diào)節(jié)作用

劉楠楠 王立英 姜 晶 董志恒 李 才

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 吉林 132013)

苯那普利對糖尿病腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子表達的調(diào)節(jié)作用

劉楠楠 王立英1姜 晶2董志恒 李 才3

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 吉林 132013)

目的 研究苯那普利對糖尿病腎病(DN)大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達的調(diào)節(jié)。方法 Wistar大鼠34只，隨機分為：對照組、DN、苯那普利組。DN組及苯那普利組大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立DN模型。于實驗第12周末處死大鼠測量大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、腎功能、尿白蛋白排泄率(UAER)及24 h尿總蛋白。應(yīng)用免疫組化方法檢測腎臟CTGF蛋白表達，并進行半定量分析。結(jié)果 與對照組相比，DN組大鼠空腹血糖、血尿素氮、血清肌酐、UAER 及24h尿總蛋白顯著升高(P<0.05或P<0.01)；腎臟CTGF表達增加(P<0.05)。DN大鼠苯那普利組各項檢測指標均較模型組顯著改善(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 苯那普利可下調(diào)DN苯那普利腎組織CTGF的表達，降低蛋白尿，保護腎功能。

腎組織;苯那普利;結(jié)締組織生長因子;糖尿病腎病

糖尿病腎病(DN)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，其主要病理特征為腎小球系膜基質(zhì)積聚、腎小球和腎小管基底膜增厚及腎間質(zhì)纖維化，已成為終末期腎衰竭和糖尿病患者死亡的主要病因〔1〕。在DN導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的過程中，結(jié)締組織生長因子(CTGF)是關(guān)鍵性細胞因子之一，參與纖維化過程〔2〕。本研究建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠模型，觀察苯那普利對DN大鼠腎組織CTGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar大鼠34只，體重197～255 g，雌雄各半，健康狀態(tài)良好，血糖正常，購自吉林省藥品檢驗實驗動物科。實驗期間所有動物自由飲水進食，保持室內(nèi)通風(fēng)、墊料干燥。

1.2 儀器、試劑及藥品 LD5- 2A醫(yī)用離心機，北京醫(yī)用離心機廠制造；日立7150型自動生化分析儀，日本生產(chǎn)；T1000電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；血糖測定儀，三諾公司；Olympus 顯微鏡，日本。STZ購自美國Sigma公司；苯那普利，購自北京諾華公司；兔抗人CTGF多克隆抗體，購自上海穎心實驗設(shè)備有限公司；尿白蛋白酶免疫法試劑盒，購自上海德波生物技術(shù)公司；血糖高靈敏度試劑盒，購自匯力生物工程技術(shù)有限公司；尿葡萄糖檢測試紙片，購自桂林中輝生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與DN模型制備 Wistar大鼠34只，隨機分為對照組(n=10)、DN模型組(n=12)、苯那普利組(n=12)。給DN組及苯那普利組大鼠腹腔一次性注射STZ 60 mg/kg。給對照組腹腔注射不含STZ的同等體積的緩沖液。72 h后由尾尖靜脈采血測量空腹血糖，當(dāng)空腹血糖≥16.7 mmol/L，3 w后檢測24 h尿蛋白定量，當(dāng)其>30 mg時，為DN模型建立成功。隨后將造模成功的大鼠分為DN組及苯那普利組。穩(wěn)定1 w后，給DN組大鼠每日灌服苯那普利10 mg·kg-1·d-1。對照組及DN組給予等量生理鹽水灌服，連續(xù)灌服12 w。實驗期間所有大鼠未給胰島素及其他降糖藥物。給實驗大鼠腹腔注射STZ后，其多飲、多食及多尿表現(xiàn)顯明。但DN組有4只死亡，而苯那普利組有3只死亡。

1.3.2 標本留取 實驗第12周時，給各組大鼠稱重，并經(jīng)尾靜脈采血測量空腹血糖，并用代謝籠收集大鼠24 h尿樣，記錄尿量，離心除掉沉渣，-20℃保存待測尿白蛋白。給所有動物乙醚麻醉，處死動物，眶后靜脈采血，肝素抗凝，分離血清(2 000 r/min,10 min)，保存于-74℃冰箱。剖開腹腔，取出腎臟，用生理鹽水清洗，去掉包膜，使用精密天平稱重，經(jīng)腎門冠狀面取腎組織，置入10%中性福爾馬林液固定待作免疫組化檢查。

1.3.3 生化指標測定 尿白蛋白排泄率(UAER)、尿素氮、空腹血糖、血肌酐采用全自動生化分析儀測定。尿總白蛋白采用雙縮脲法測定。

1.3.4 免疫組化測定 將已用10%福爾馬林液固定的腎組織，石蠟包埋，制片4 μm厚，二甲苯脫蠟，酒精脫水，滴加3%甲醛H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加兔抗人CTGF多克隆抗體(1∶100)工作液，室溫孵育60 min，此后加入生物素標記山羊抗兔IgG，室溫孵育20 min，再加入鏈霉素生物素辣根過氧化物酶工作液，室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，樹膠封片，磷酸鹽緩沖液(PBS)替代Ⅰ抗作陰性對照。對圖像進行分析應(yīng)用Image- pro plus圖像分析系統(tǒng)，隨機選取8個不重疊視野(×400)，測定陽性染色部位的積分光密度值為半定量分析值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量、腎質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量狀況 實驗前各組大鼠體質(zhì)量均無明顯不同。成模后在實驗第12周時，DN組及苯那普利組大鼠體質(zhì)量減輕，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)。苯那普利組成模后至12 w末時體質(zhì)量較DN組明顯增加(P<0.05)。但苯那普利組腎質(zhì)量/體質(zhì)量與DN組比較顯著降低(P<0.01)，見表1。

2.2 生化指標 實驗前各組大鼠血糖比較均無明顯差異。12 w末時，苯那普利組與DN組空腹血糖較對照組顯著增高(P<0.01)，苯那普利組與DN組顯著降低(P<0.01)。腎功能指標，DN組大鼠UAER、尿總蛋白、尿素氮、血肌酐較對照組顯著升高(P<0.01)，與DN組比較，苯那普利組UAER、尿總蛋白、血肌酐及尿素氮均明顯下降(P<0.01)，見表2。

2.3 腎組織CTGF的表達 免疫組化結(jié)果顯示，CTGF在腎小球系膜細胞、上皮細胞及系膜區(qū)的陽性表達呈棕黃色顆粒。CTGF在對照組大鼠腎小球內(nèi)表達微弱(呈輕微著色，僅見少量淺淡黃色顆粒)；DN組大鼠CTGF表達明顯增強(著色加深，呈棕黃色)；苯那普利組大鼠CTGF表達較DN組減輕(著色變淺，呈淺黃色)。見圖1。半定量結(jié)果表明，DN組(0.50±0.09)較對照組(0.31±0.05，P<0.05)顯著增強；苯那普利組(0.38±0.07)較DN組顯著降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量比較

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與DN組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

表2 各組相關(guān)指標比較

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

圖1 腎組織CTGF免疫組化染色結(jié)果(DAB，×400)

3 討 論

DN的明確發(fā)病機制并不十分清楚，目前認為多種因素可能與DN的發(fā)生有關(guān)。但在DN機制中CTGF的作用越來越受到廣泛關(guān)注。CTGF屬于即刻早期基因CCN家族成員之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，CTGF與包括血管、心臟、腎臟、胰腺、肺及肝臟等在內(nèi)的許多組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3～5〕。正常情況下，體內(nèi)的CTGF表達很低或無表達，但在腎等器官病理狀態(tài)下，便會出現(xiàn)CTGF過度表達〔6〕。初步研究表明，在腎臟疾病時，CTGF主要表達于腎臟中起源于中胚層的固有細胞，如臟層上皮細胞、壁層上皮細胞、系膜細胞〔7〕。Ren等〔8〕在研究中發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，腎臟分泌或產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF- β)，進而促進CTGF等細胞因子的作用。但從DN早期開始系膜細胞與腎小球足細胞的CTGF表達呈顯著升高〔9〕。

正常狀態(tài)下，CTGF的含量很低，高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及機械應(yīng)力等作用可以使CTGF過度表達，結(jié)果引起細胞外基質(zhì)(ECM)成分，如纖維連接蛋白(FN)，膠原等的增多，并參與DN發(fā)生〔10〕。研究提示，CTGF可能是TGF- β1促纖維化活性的下游信號介質(zhì)，在刺激細胞增殖及ECM的形成、促進組織器官纖維化方面起重要作用〔11〕。AGEs是高血糖環(huán)境中糖與蛋白質(zhì)上的游離氨基酸、脂肪及核酸之間反應(yīng)形成，當(dāng)AGEs同特異受體結(jié)合影響生長因子及細胞因子如CTGF與TGF- β的表達，導(dǎo)致ECM的合成和降解失衡，引發(fā)腎纖維〔12〕。高血糖狀態(tài)下，腎組織CTGF產(chǎn)生增多，可能是由于糖尿病糖代謝紊亂所致。因此控制高血糖，減少AGEs的形成，也是防止糖尿病發(fā)展為DN的重要措施。

本研究結(jié)果提示，應(yīng)用苯那普利對DN大鼠進行干預(yù)，可明顯減輕其腎臟的病理性損傷，其作用機制很可能與苯那普利下調(diào)DN大鼠腎組織中CTGF的表達有關(guān)。已有研究證實，在DN早期即有血、尿及腎組織中CTGF水平增高〔13〕。尿中CTGF濃度與DN的嚴重程度，即UAER和腎小球濾過率呈正相關(guān)〔10〕。尿蛋白增多不僅是DN損害的表現(xiàn)，而且也是腎病和心血管病進展的重要因素〔14〕，說明腎組織中CTGF表達水平的變化通常與DN的嚴重程度密切相關(guān)。本實驗結(jié)果提示，苯那普利通過抑制DN大鼠腎組織中CTGF的表達，而發(fā)揮其保護腎功能的作用機制。

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〔2016- 01- 28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

劉楠楠 (1976- )，女，醫(yī)學(xué)博士，副教授， 主要從事糖尿病腎病及腫瘤分子病理研究。

R587.2

A

1005- 9202(2017)15- 3659- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.008

1 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室 2 北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 3 吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所