貴州兩市豬源大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測

杜安定，譚艾娟＊ ，陳 婷，李悅欣，王珍燕，杜國琴

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

貴州兩市豬源大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測

杜安定，譚艾娟＊ ，陳 婷，李悅欣，王珍燕，杜國琴

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

為了解貴州安順、遵義市豬源細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，采用CLSI 推薦的雙紙片擴散法，調(diào)查108株臨床分離的大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌的比例。結(jié)果表明：遵義、安順兩市108株大腸桿菌確認有72株ESBLs 陽性菌株，檢出率66.7%(72/108)，其中遵義市（79.6%，43/54）檢出率高于安順市（53.7%，29/54），兩市豬源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的檢測率較高，對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥較為嚴重。

耐藥性；β-內(nèi)酰胺類抗生素；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌

β-內(nèi)酰胺類抗生素毒副作用小，抗菌活性強，抗菌譜廣，是人醫(yī)臨床上和獸醫(yī)臨床最常用的抗生素，隨著此類藥物的廣泛應用，導致細菌的耐藥性增強，同時也造成畜產(chǎn)品中的抗生素藥物殘留增加，危害了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。細菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶降解此類抗生素是其耐藥的主要機制，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases ESBLs）主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌等G-菌產(chǎn)生，可水解滅活青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，細菌產(chǎn)生ESBLs后可對多種β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥[4]，因此，可通過調(diào)查區(qū)域內(nèi)ESBLs菌株的比例來評價該區(qū)域內(nèi)細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥水平[5]。本研究對貴州省遵義、安順兩市豬源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株的比例進行了調(diào)查，以期對兩市β-內(nèi)酰胺類抗生素的正確選用和降低細菌耐藥性危害提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實驗菌株：已鑒定的108株豬源大腸桿菌分別采自貴州遵義和安順地區(qū)。

質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株ATCC 25922，購自中國獸藥監(jiān)察所。

表1 藥敏紙片

1.1.2 培養(yǎng)基

LB肉湯：用于活化細菌。米勒-海頓瓊脂（MHA）：規(guī)格250 g/瓶，批號111226，購自上海博微生物科技有限公司。

1.1.3 藥物

藥敏紙片：見表1。

1.2 方法

產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細菌篩選：按CLSI 推薦的紙片擴散法進行操作和結(jié)果判讀[6-7]。一般情況抑菌圈＜ 10 mm為低敏， 10 mm＜抑菌圈＜ 15 mm為中敏，15 mm＜抑菌圈＜ 20 mm為高敏，抑菌圈＞ 20 mm為極敏，無抑菌圈為不敏感[7]。

初篩實驗：將受試菌株均勻涂布于M-H瓊脂平板，貼頭孢他啶（30 μg/片)和頭孢噻肟（30 μg/片)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h。當兩個藥物抑菌圈直徑滿足以下任一條件：即頭孢他啶 ≤ 22 mm，頭孢噻肟 ≤ 27 mm，判定為疑產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株，需進一步作確證試驗。以大腸埃希菌ATCC 25922作陰性對照，同時以肺炎克雷伯菌ATCC700603作陽性對照。

確證實驗：將受試菌株均勻涂布于M-H 瓊脂平板，分別貼頭孢他啶（30 μg/ mL)、頭孢他啶/克拉維酸（30/10 μg/片）以及頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸（30/10 μg/片）2 組紙片，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，細菌對兩個中任何一個藥物加克拉維酸后抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值 ≥ 5 mm時，判定為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細菌判定

如圖1所示，頭孢他啶抑菌圈 ≤ 22 mm，頭孢噻肟抑菌圈 ≤ 27 mm；同時，頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈 －頭孢噻肟抑菌圈 ≥ 5 mm，頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈－頭孢他啶抑菌圈 ≥ 5 mm，因此，判定該菌為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株。

2.2 遵義、安順兩市產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢測結(jié)果

108株大腸桿菌經(jīng)初篩和確證試驗，有72株ESBLs陽性菌株，檢出率66．7%，72/108，其中遵義市檢出率（79．6%，43/54）遠高于安順市的（53．7%，29/54），詳見表2。

表2 108株大腸桿菌ESBLs菌檢測結(jié)果

圖1 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌雙紙片篩選結(jié)果

3 討論

從青霉素應用于細菌感染的治療后近100年來，抗菌藥物有效降低了人和動物的細菌感染性疾病的危害，給人類健康和生活水平的改善帶來巨大的福音。隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥水平不斷升高，使臨床治療失敗的風險不斷加大，對人類健康和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅。β-內(nèi)酰胺類藥物高效、低毒、廣譜，是臨床最重要的抗生素，其包括青霉素類、頭孢菌素類和非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素等。細菌可通過產(chǎn)生降解藥物的β-內(nèi)酰胺酶、改變靶點對藥物的親和力、降低本身細胞膜的通透性、增強主動外排等方式獲得對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥[8]；而產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細菌獲得高度耐藥的主要方式，而ESBLs由質(zhì)粒介導，其可在不同細菌間廣泛傳播，產(chǎn)生對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥，在耐藥基因水平傳播中發(fā)揮重要作用。

2005-2012年中國細菌耐藥監(jiān)測（CH INET）結(jié)果顯示大腸桿菌中產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率高[9]，并呈逐年增加的趨勢上升，直至2012年的檢出率高達55．3%。估計2012年至今，其結(jié)果一直處于上升趨勢[10]；本研究顯示也符合上述推斷。遵義市、安順市豬源產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌檢出率分別為79．6%和53．7%，明顯高于趙鳳菊[11]等報道的遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs 30．77%的檢出率。說明β-內(nèi)酰胺類抗生素在該兩市的豬場中的使用率高于國內(nèi)部分地區(qū)。

建議兩市應減少β-內(nèi)酰胺類抗生素在豬場的使用，以恢復細菌對此類藥物的敏感性。

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2017-06-19)

貴陽市農(nóng)委科學技術(shù)計劃項目（貴陽市屠宰場豬肉致病菌污染調(diào)查及防控措施研究［ 筑科合（2010）12 -11］）

杜安定（1992-） , 男, 貴州湄潭人， 碩士研究生， 研究方向：生物化學與分子生物學

譚艾娟（1963-）， 女， 教授， 從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：ajtan@gzu.edu.cn