TLR4/NF-κB通路在異氟醚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用

蘆曼 陳永權(quán)

●論 著

TLR4/NF-κB通路在異氟醚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用

蘆曼 陳永權(quán)

目的 探討TLR4/NF-κB信號通路在異氟醚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用，為防治心肌缺血/再灌注損傷提供新的理論依據(jù)。 方法 將成年雄性SD大鼠40只隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注損傷組（IR組）、異氟醚預(yù)處理組（ISO組）、TLR4抑制劑TAK-242組(T組)、異氟醚+TAK-242預(yù)處理組（ISOT組），每組8只。S組左冠狀動脈前降支只穿線不結(jié)扎；IR組只進(jìn)行缺血再灌注；ISO組：吸入1.0MAC異氟醚30min，停止吸入15min；T組：予尾靜脈注射TLR4受體抑制劑TAK-242（10mg/kg）；ISOT組：吸入異氟醚前1min尾靜脈注射TAK-242（10mg/kg），之后建立缺血再灌注模型。再灌注完成后取出心臟，HE染色在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化并測定各組大鼠心肌梗死面積；分別采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測心肌組織中TLR4受體在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上的變化，以及NF-κB的表達(dá)情況。結(jié)果 與IR組比較，其余各組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.01）；與ISO、T組比較，ISOT組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）；與ISO組比較，T組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）。與IR組比較，其余各組NF-κB的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與T、ISOT組比較，ISO組NF-κB的表達(dá)均明顯降低（均P＜0.01）。與IR組比較，其余各組心肌梗死面積均明顯減少（P＜0.01）；與ISO組和T組比較,ISOT組心肌梗死面積顯著減小（P＜0.01）；而ISO組和T組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 TLR4/NF-κB信號通路參與了異氟醚預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

缺血再灌注損傷 心肌保護(hù) 異氟醚 TLR4 NF-κB

心肌缺血再灌注損傷是心肺復(fù)蘇（CPR）、心肌梗死溶栓、心臟移植以及心臟瓣膜置換等治療過程中心肌發(fā)生的主要病理生理過程。近年來，隨著心臟手術(shù)及心臟病非心臟手術(shù)的開展，人們發(fā)現(xiàn)異氟醚預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路對缺血再灌注的大鼠心肌起保護(hù)作用[1]。然而，異氟醚是否通過TLR4/NF-κB這條信號通路起到心肌保護(hù)作用尚不得而知。筆者旨在探究TLR4/NF-κB信號通路在異氟醚預(yù)處理心肌保護(hù)中起的作用進(jìn)行了研究，以期為異氟醚的心肌保護(hù)機(jī)制探索提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級成年雄性SD大鼠40只，體重（300± 20）g，購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)公司。大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在18～22℃，飼養(yǎng)環(huán)境符合12h晝夜循環(huán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組處理 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（IR組）、異氟醚預(yù)處理組（ISO組）、TAK-242抑制劑組（T組）和異氟醚+ TAK-242預(yù)處理組（ISOT組），每組8只。S組：左冠狀動脈前降支穿5-0線不結(jié)扎持續(xù)150min；IR組：建立缺血再灌注模型；ISO組：先吸入1.0 MAC的異氟醚30min，接著吸入30%氧濃度的空氣15min，建立缺血再灌注模型；T組：參照文獻(xiàn)[2]，尾靜脈注射TLR4抑制劑TAK-242（10mg/kg），后行缺血再灌注；ISOT組：吸入異氟醚前1min尾靜脈注射TAK-242（10mg/kg），然后吸入1.0MAC異氟醚30min，接著吸入30%氧氣15min，后建立缺血再灌注模型。

1.3 大鼠缺血再灌注模型制備 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食8h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉30~40mg/kg進(jìn)行麻醉。翻正反射消失后將大鼠仰臥固定，行氣管切開插管，接小動物呼吸機(jī)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)）行機(jī)械通氣，吸入氧濃度為30%，潮氣量為10～15ml/kg，頻率60～70次/min，根據(jù)血?dú)庹{(diào)節(jié)呼吸頻率和潮氣量，維持PaCO2在25～40mmHg，保持室溫在25℃。手術(shù)部位備皮后用碘伏消毒，持續(xù)監(jiān)測大鼠心電活動。于左側(cè)第3、4肋，依次切開皮膚、胸前組織、肋間肌肉，開胸后使用眼科專用撐開器撐開肋骨，打開心包，暴露出心臟，于左心耳根部下方2mm處，穿入5-0無損傷縫合線，縫線末端穿入自制的橡皮圈套管，結(jié)扎左冠狀動脈錢降支30min。當(dāng)心電圖顯示ST段弓背向上抬高，結(jié)扎線下心肌顏色變暗，左心室發(fā)紺蒼白時(shí)，認(rèn)定心肌已經(jīng)缺血，剪斷結(jié)扎線后再灌注120min，原蒼白區(qū)出現(xiàn)充血反應(yīng)即為再灌注成功的標(biāo)志。于再灌注120min后處死大鼠，同時(shí)迅速切取病變心?。òㄟ吘壊糠终Ｐ募。┙M織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于-80℃冰箱備用。排除心肌缺血再灌注模型制備時(shí)心肌缺血前心電圖有異常以及實(shí)驗(yàn)過程未結(jié)束就死亡的大鼠。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 RT-PCR測定TLR4 mRNA表達(dá) 用Trizol法提取心肌組織總RNA，用紫外線分光度測量A260/280的比值鑒定RNA的純度和濃度。取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件：65℃5min，37℃50min，70℃10min。以GAPDH為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物：GAPDH上游為TGGAGTCTACTGGCGTCTT，下游為TGTCATATTTCTCGTGGTTC，擴(kuò)增產(chǎn)物138bp；TLR4上游為CTGCATAGAGGTAGTTCCT，下游為TCCAGCCACTGAAGTTCTGA，擴(kuò)增產(chǎn)物128bp。通過逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 2μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃15s，60℃60s,循環(huán)擴(kuò)增后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)觀察和分析。

1.4.2 Western-blot測定TLR4、NF-κB的表達(dá) 選取心肌組織（5mg）放于無菌EP管中，加入200μl裂解液。用勻漿器將組織勻漿直至充分裂解。離心機(jī)設(shè)置于12 000r，離心10min，離心后取出上清液。各細(xì)胞樣本的蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，灌膠上樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，待電泳使染料達(dá)分離膠的適當(dāng)位置時(shí)停止電泳。半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，洗膜，按照對應(yīng)分子量切割后分別置于1∶300稀釋的兔抗大鼠 TLR4、NF-κBp65一抗溶液中，4℃雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶3 000稀釋的二抗，搖床上雜交1h，然后取出用洗膜液沖洗，ECL顯色，采用Image J軟件分析灰度值。

1.4.3 光鏡檢查 將取下的左心室經(jīng)石蠟包埋后，制成病理切片后HE染色，由同一位研究人員在光鏡下觀察各切片的病理改變。待找到典型梗死區(qū)域，拍照后在形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（JEDA801D，捷達(dá)）上分析各個(gè)截面的梗死面積，結(jié)果以梗死區(qū)面積占視野區(qū)面積的百分比表示。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠TLR4 mRNA、TLR4以及NF-κB表達(dá)的比較 與IR組比較，其余各組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)均明顯降低（均P＜0.01）；與ISO、T組比較，ISOT組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）；T組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)低于ISO組（均P＜0.01）。與IR組比較，其余各組NF-κB表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01）；與T、ISOT組比較，ISO組NF-κB表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01），詳見表1。

表1 各組大鼠T L R 4 m R N A、T L R 4以及N F-κB表達(dá)的比較

2.2 各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)光鏡檢查結(jié)果 S組心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞形態(tài)正常，炎性細(xì)胞少見，心肌纖維排列較緊密。IR組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞萎縮，橫紋消失，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤明顯，間質(zhì)出血明顯，心肌纖維走向紊亂。ISO組與T組能減少心肌組織損傷，心肌細(xì)胞萎縮，間質(zhì)出血及炎性細(xì)胞浸潤較IR組有所減輕。ISOT組則能明顯減輕心肌細(xì)胞受損情況，其光鏡下的微觀變化與S組基本接近（圖1）。

圖1 各組心肌細(xì)胞光鏡檢查結(jié)果（a：S組；b：I R組；c：I S O組；d：T組；e：I S O T組；H E染色，×1 0 0）

2.3 各組大鼠心肌梗死面積的比較 與IR組比較，其余各組心肌梗死面積均明顯減少（均P＜0.01）；ISOT組與ISO組和T組比較，心肌梗死面積均明顯減小（均P＜0.01）；而ISO組和T組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積的比較（%）

3 討論

隨著缺血性心肌病發(fā)病率的不斷升高，缺血性心肌病已成為心臟病非心臟手術(shù)的主要死亡原因，而缺血再灌注損傷成為了當(dāng)今臨床要解決的難題。全身麻醉藥物種類繁多，選用具有心肌保護(hù)作用的麻醉藥物有助于提高心臟手術(shù)及心臟病非心臟手術(shù)預(yù)后。吸入麻醉藥如異氟醚、七氟醚在已證實(shí)可產(chǎn)生類似于缺血預(yù)適應(yīng)的效應(yīng)，增強(qiáng)缺血后的心肌功能，減少心肌梗死面積，從而起到心肌保護(hù)作用[3]。Cason等[4]于1997年率先用實(shí)驗(yàn)證明了吸入麻醉藥異氟醚預(yù)處理較IR組可以使兔心肌梗死面積明顯縮小，這種作用被稱為麻醉藥物預(yù)處理（APC）。Li等[5]通過實(shí)驗(yàn)證明了異氟醚預(yù)處理對缺血再灌注大鼠的心臟保護(hù)強(qiáng)于七氟醚，他們發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后1h，七氟醚和異氟醚預(yù)處理組和IR組比較，雖都有心肌保護(hù)作用，但七氟醚預(yù)處理組的左心室收縮功能只能恢復(fù)到基礎(chǔ)值的23%，異氟醚組則可恢復(fù)到42%。同時(shí)，另一項(xiàng)研究證實(shí)用1%~2%異氟醚預(yù)處理可達(dá)到對缺血再灌注心肌的延遲性保護(hù)作用，并且不會對心血管有明顯的抑制[6]。因此本實(shí)驗(yàn)選用1.0MAC異氟醚進(jìn)行預(yù)處理。

TLR4作為炎癥反應(yīng)的其中一個(gè)閘門，其適度表達(dá)可開啟正常的防御以維持機(jī)體功能穩(wěn)定；但若過度表達(dá)則可引起相關(guān)的組織損傷。而心肌缺血再灌注損傷主要原因就是炎癥反應(yīng)與心肌細(xì)胞死亡的惡性循環(huán)。TLR4對LPS識別的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有接頭蛋白髓樣細(xì)胞分化因子（MyD88）依賴的信號通路和MyD88非依賴的信號通路[7]。在TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，這兩條通路分別引起早期和晚期的NF-κB活化。TLR4介導(dǎo)LPS胞內(nèi)信號傳遞至少要涉及幾條通路，但最終都要激活NF-κB或絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）。

NF-κB是調(diào)控多基因轉(zhuǎn)錄的防御性蛋白，主要通過調(diào)控炎癥介質(zhì)的釋放和細(xì)胞凋亡參與心肌缺血再灌注的病理生理過程。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與心肌細(xì)胞凋亡是密切相關(guān)的[8]，大量研究證實(shí)通過抑制 NF-κB的活化，下調(diào)該通道下游的促炎因子的表達(dá)，可促進(jìn)缺血再灌注后心功能的恢復(fù)[9-12]。其作用機(jī)制為：NF-κB與抑制性蛋白IκB結(jié)合后以二聚體的形式存在于胞質(zhì)中呈無活性狀態(tài)，當(dāng)一些刺激性因素，如心肌缺血再灌注可通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使NF-κB-IκB二聚體解體,無活性的NF-κB活化，并借助核定位信號（NLS）入細(xì)胞核內(nèi),在核內(nèi)與NF-κB靶基因的特異性序列結(jié)合從而啟動轉(zhuǎn)錄，過度表達(dá)一些炎性因子、黏附分子，從而誘發(fā)加重MIRI[13]。

楊晶等[1]證實(shí)，TLR4受體的激活可通過MyD88激活下游的NF-κB通路。本研究中使用了TLR4通路抑制劑TAK-242。TAK-242能通過結(jié)合TLR4胞內(nèi)區(qū)域抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，作為新型的TLR4受體阻滯劑，具有分子量小、能迅速分布到組織達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果顯示：與IR組比較，使用TLR4抑制劑TAK-242后，TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達(dá)明顯下降、NF-κB表達(dá)也相應(yīng)下降、心肌梗死面積減少，驗(yàn)證了TLR4/NF-κB信號通路參與大鼠心肌缺血再灌注損傷。同時(shí)，使用異氟醚預(yù)處理也顯著下調(diào)了TLR4 mRNA和TLR4蛋白及NF-κB表達(dá)水平、縮小了心肌梗死面積。由此可認(rèn)為TLR4/NF-κB信號通路參與了異氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。

TLR4/NF-κB信號通路只是異氟醚心肌保護(hù)眾多信號通路中的一條，而研究發(fā)現(xiàn)，在此條信號通路上的TLR4、NF-κB等都存在有多種上下游物質(zhì)，而且各個(gè)靶點(diǎn)的具體位置及上下游物質(zhì)相互之間關(guān)系尚未明確。因此找尋此條通路上各個(gè)重要靶點(diǎn)的具體位置及上下游之間存在何種具體聯(lián)系將成為日后進(jìn)一步研究的方向。

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Isoflurane preconditioning protects myocardium after ischemic-reperfusion injury in rats through toll-like receptor 4/NF-κB signaling pathway

LU Man,CHEN Yongquan.Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China

Ischemia reperfusion injury Isoflurane Myocardial preservation Toll-like receptor 4 NF-κB

2 0 1 7-0 1-0 9）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

d o i：1 0.1 2 0 5 6/j.i s s n.1 0 0 6-2 7 8 5.2 0 1 7.3 9.1 5.2 0 1 7-6 3

3 1 0 0 0 6 杭州，浙江省中醫(yī)院麻醉科（蘆曼）；皖南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科（陳永權(quán)）

陳永權(quán)，E-m a i l:c h e n y q 2 6 3@1 6 3.c o m

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of isoflurane preconditioning on myocardium after ischemia/reperfusion (I/R)injury in rats and its relation to toll-like receptor 4(TLR4)/NF-κB signaling pathway. Methods Forty SD rats were randomly divided into five groups with 8 in each:sham-operated group (group S),ischemia/reperfusion group (group IR),isoflurane preconditioning group(group ISO),TAK-242 inhibitor group(group T)and isoflurane preconditioning and TAK-242 inhibitor group (group ISOT).The rats were given 1.0 MAC isoflurane inhalation for 30min before I/R induced;TLR4 receptor inhibitor TAK-242 10mg/kg was injected through tail vein 1 minute before inhaling isoflurane,and ischemic/reperfusion model was induced by ligation of anterior descending coronary artery.The myocardial tissue samples were obtained at the end of reperfusion.The size of myocardial infarction was measured by light microscope with HE staining.The expression of TLR4 mRNA and protein in myocardial tissue was detected by RT-PCR and Western blot,respectively,the expression of NF-κB was detected by Western blotting. Results Compared with group IR,the expression levels of TLR4 mRNA and protein was significantly lower in other groups(P＜0.01),compared with groups ISO and T,the expression of TLR4 mRNA and protein was down-regulated significantly (P＜0.01)in group ISOT,compared with group ISO,the expression of TLR4 mRNA and protein was down-regulated significantly (P＜0.01)in group T.Compared with group IR,the expression of NF-κB protein in other groups decreased significantly(P＜0.01), compared with groups T and ISOT,the expression of NF-κB protein in group ISO decreased significantly(P＜0.01).Compared with group IR,the size of myocardial infarction in other experimental groups were significantly reduced(P＜0.01),compared withgroup ISO and T,the infarct size was significantly reduced in group ISOT(P＜0.01),and there was no difference between group ISO and group T(P＞0.05). Conclusion TLR4/NF-κB signaling may be involved in protective effect of isoflurane preconditioning against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.