箍圍藥紅腫消酊對皮膚膿腫大鼠血漿殺菌/通透性增加蛋白、消退素D1的影響

王婉瑩，朱朝軍，徐 強(qiáng)，劉婷婷，張朝暉

箍圍藥紅腫消酊對皮膚膿腫大鼠血漿殺菌/通透性增加蛋白、消退素D1的影響

王婉瑩1，朱朝軍2，徐 強(qiáng)2，劉婷婷1，張朝暉2

目的：觀察箍圍藥紅腫消酊外用對皮膚膿腫大鼠血漿內(nèi)殺菌/通透性增加蛋白（BPI）、消退素D1(RvD1)表達(dá)的影響。方法：將40只大鼠分為空白組、模型組、對照組、預(yù)治療組、治療組，除空白組外，其余4組皮下注射金黃色葡萄球菌造成皮下膿腫模型，模型組生理鹽水紗條換藥，對照組在注射細(xì)菌3 d后出現(xiàn)硬腫立即百多邦外涂換藥，預(yù)治療組在注射細(xì)菌后4 h立刻紅腫消酊2 mL換藥，治療組在注射細(xì)菌3 d后出現(xiàn)硬腫立即紅腫消酊2 mL換藥，藥物范圍超過腫脹范圍1 cm，1次/d。分別于治療3 d、7 d、14 d、18 d心臟取血2 mL，ELISA法檢測血漿內(nèi)BPI、RvDl的表達(dá)。結(jié)果：除空白組外，其他用藥4組血漿內(nèi)BPI、RvDl含量均有不同程度的增高。在治療3 d、7 d應(yīng)用紅腫消酊的預(yù)治療組血漿內(nèi)BPI含量升高明顯，治療7 d時，預(yù)治療組與模型組相比升高明顯，差別有統(tǒng)計學(xué)意義[（247±27.89）vs（225±13.75）ng/L，P＜0.05]；治療14 d、18 d血漿內(nèi)BPI表達(dá)量逐漸下降，預(yù)治療組與對照組相比血漿內(nèi)BPI表達(dá)量明顯下降的勢態(tài)，[(193±30.41)，(183±26.95)vs(217±19.28)，(205±23.89)ng/L，P＜0.05]，血漿內(nèi)RvDl含量的表達(dá)在治療過程中呈現(xiàn)不斷增長勢態(tài)，治療14 d時，預(yù)治療組[（2.11±0.24）ng/mL]、治療組[（2.10±0.23）ng/mL]與模型組[（1.76±0.20）ng/mL]相比血漿內(nèi)RvDl含量表達(dá)呈增高的勢態(tài)（P＜0.05）；治療18 d時，預(yù)治療組[（2.17±0.27）ng/mL]、治療組[（2.27±0.26）ng/mL]與模型組[（1.74±0.19）ng/mL]相比血漿內(nèi)RvDl含量表達(dá)明顯增高（P＜0.01）。結(jié)論：應(yīng)用紅腫消酊換藥治療大鼠皮膚膿腫，可有效提高血漿內(nèi)BPI、RvDl的含量水平，從而起到止痛、抗炎、抑制水腫等作用，促進(jìn)護(hù)場形成，加速瘡面愈合。

護(hù)場理論；箍圍法；紅腫消酊；殺菌/通透性增加蛋白含量；消退素D1

皮膚及軟組織感染是由化膿性致病菌侵犯表皮、真皮及皮下組織引起的炎癥性疾病，涉及范圍從淺表的局限性感染，到深部組織壞死性感染[1]。護(hù)場理論是中醫(yī)外科獨特的理論，在其指導(dǎo)下，應(yīng)用箍圍藥物促進(jìn)感染的局限或消散，使之護(hù)場形成。本文將外敷自擬方紅腫消酊（箍圍藥）對模型大鼠皮膚膿腫形成、局限過程中殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)及消退素D1（Resolvin D1,RvDl）含量變化測定的結(jié)果，以期了解其對炎癥過程發(fā)揮功效的治療原理，揭示其促護(hù)場形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 紅腫消酊由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供。藥物組成：姜黃、大黃、黃柏、蒼術(shù)、厚樸、陳皮、甘草、生天南星、白芷、天花粉、金銀花等。

百多邦：莫匹羅星軟膏，中美史克，國藥準(zhǔn)字H10930064。適用于：革蘭陽性球菌引起的皮膚感染，例如：膿皰病、癤腫、毛囊炎等原發(fā)性皮膚感染及濕疹合并感染、不超過10 cm×10 cm面積的淺表性創(chuàng)傷合并感染等繼發(fā)性皮膚感染。

1.2 菌株來源 金黃色葡萄球菌為金黃色葡萄球菌ATCC25923株，由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病原學(xué)系免疫教研室、中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家重點學(xué)科和國家中醫(yī)藥管理局重點學(xué)科免疫實驗室提供。菌液中金黃色葡萄球菌含量為（3～5）×109cfu/ mL。菌液制備：取金黃色葡萄球菌，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，取下菌落，加適量無菌氯化鈉注射液研磨，制成每毫升含細(xì)菌3～5億個金黃色葡萄球菌菌液。

1.3 試劑 BPI為（ELISA，天津瑞博星科技有限公司）；RvDl為（ELISA，天津瑞博星科技有限公司）。

1.4 動物及分組 SD大鼠40只，（280±20）g，雌雄各半，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[動物許可證號SCXK-(軍)2012-0004]。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分5組：⑴空白對照組：皮下注射生理鹽水，正常喂養(yǎng)，不做處理。⑵預(yù)治療組：皮下注射金黃色葡萄球菌造成感染，注射后4 h立即紅腫消酊換藥，1次/d。⑶治療組：皮下注射金黃色葡萄球菌造成感染，3 d后出現(xiàn)硬腫立即紅腫消酊換藥，1次/d。⑷對照組：皮下注射金黃色葡萄球菌，3 d后出現(xiàn)硬腫用百多邦外涂換藥，1次/d。⑸模型組：皮下注射金黃色葡萄球菌造成感染，生理鹽水紗條換藥，1次/d。

1.5 造模方法 采用注射器皮下注射細(xì)菌的方法,將大鼠后背中點的皮下作為注菌的部位。細(xì)菌注射通過1 mL注射器提起皮膚，從尾端向頭端皮下注射菌液1 mL，使皮丘在圓形觀察范圍的中央。

1.6 觀察指標(biāo) 分別于治療3 d、7 d、14 d、18 d行心臟取血2 mL左右，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測BPI、RvDl的含量。應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠BPI、RvDl水平。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠BPI、RvDl濃度。具體方法參照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件由及Grapad Prism 5.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)的比較采用配對的t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并用LSD進(jìn)行驗后多重比較，以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組BPI含量變化 各組BPI含量在各檢測時間點較空白組都呈增加態(tài)勢。與空白組相比，治療3 d、7 d、14 d、18 d時模型組、對照組、預(yù)治療及治療組的BPI含量差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠BPI含量變化（±s,ng/L,n=8）

表1 各組大鼠BPI含量變化（±s,ng/L,n=8）

注：與空白組相比,aP＜0.01；與模型組相比,bP＜0.05,bbP＜0.01

組別空白組模型組對照組預(yù)治療組治療組n8 8 8 8 8 3 d 105±8.30 211±17.17a199±23.44a215±22.17a209±13.16a7 d 105±8.30 225±13.75a255±16.76a、bb247±27.89a、b217±14.09a、bb 14 d 105±8.30 194±16.89a217±19.28a、b193±30.41a、b178±19.11a、bb 18 d 105±8.30 174±15.53a205±23.89a、bb183±26.95a168±12.09a、bb

2.2 各組的RvDl含量 各組的RvDl含量在各檢測時間點較空白組都呈增高趨勢。各治療時間點、各組（除治療組18 d時）血漿內(nèi)RvDl含量與空白組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。治療14 d、18 d時，預(yù)治療組、治療組與模型組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠RvDl含量變化（±s,ng/mL,n=8）

表2 各組大鼠RvDl含量變化（±s,ng/mL,n=8）

注：與空白組相比，aP＜0.05,aaP＜0.01；與模型組相比，bP＜0.05，bbP＜0.01

組別空白組模型組對照組預(yù)治療組治療組n8 8 8 8 8 3 d 2.53±0.30 1.82±0.25aa1.87±0.20aa1.84±0.32aa1.95±0.19aa7 d 2.55±0.29 1.71±0.27aa2.04±0.35aa、b1.97±0.27aa1.97±0.14aa14 d 2.57±0.32 1.76±0.20aa2.04±0.26aa2.11±0.24aa、b2.1±0.23aa、b 18 d 2.56±0.31 1.74±0.19aa2.26±0.21a、bb2.17±0.27aa、bb 2.27±0.26bb

3 討論

當(dāng)炎癥侵入機(jī)體，會刺激機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的促炎因子及抗炎因子，二者在膿腫的發(fā)展與控制過程中發(fā)揮重要作用。其中BPI、RvDl作為抗炎因子，目前被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)的消退過程中扮演著重要角色，本研究主要探討應(yīng)用護(hù)場理論指導(dǎo)下的箍圍藥紅腫消酊對皮膚膿腫大鼠血漿BPI、RvDl的影響。

BPI是普遍存在于人和哺乳動物體內(nèi)中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中的一種抗菌蛋白質(zhì)，具有極強(qiáng)的殺滅革蘭陰性菌和中和內(nèi)毒素（LPS）的雙重特性，被譽(yù)為“超級抗生素”[2]，是機(jī)體對抗外源微生物特別是致病菌的第一道防線，是非常重要的天然存在的防御武器之一[3]。且還有免疫調(diào)節(jié)作用的抗菌物質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體的天然及抗感染免疫、抑制炎性物質(zhì)釋放等一系列特異性功能[4-5]。相關(guān)研究[6]表明BPI可以明顯的降低LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，抑制LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這就為BPI抑菌機(jī)制及功能提供了實驗依據(jù)。BPI為內(nèi)源性抗菌肽，不僅對革蘭陰性菌產(chǎn)生抑制作用，還對革蘭陽性菌及真菌具有較強(qiáng)的殺傷作用，是一種新型抗菌功效的抑炎因子，其具有良好發(fā)展前景。有報告提到BPI-BD3（基因重組bactericidal permeability increasing protein，human beta defensins 3）修飾的C3H10T1/2能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌所致的小鼠感染創(chuàng)面的愈合[7]。

本實驗研究中，在治療的早、中、后期，模型組、對照組、預(yù)治療組及治療組機(jī)體內(nèi)BPI的含量都明顯高于空白組，提示著BPI存在于金黃色葡萄球菌所致的感染中，且BPI的表達(dá)和感染的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。在皮下感染過程的早期（3 d、7 d），應(yīng)用紅腫消酊的預(yù)治療組和治療組機(jī)體內(nèi)的BPI都呈現(xiàn)出明顯升高的勢態(tài)，提示著機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了大量的BPI，對于炎癥的抑制、護(hù)場的形成及瘡面的愈合都起到了重要的作用。

RvDl主要產(chǎn)生于炎癥反應(yīng)的消退階段，是人體中非常重要的促炎癥消退因子[8]，主要調(diào)節(jié)著炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，正向調(diào)節(jié)組織恢復(fù)到平穩(wěn)[9]，被喻為炎癥反應(yīng)的“剎車信號”[10]。消退素也是一類從炎癥消退期分離出的新型脂類介質(zhì)，其具有抗炎、促消退的作用[11]。在以往的研究表明，消退素可以抑制白細(xì)胞在血管壁的滾動、減輕炎癥部位白細(xì)胞的滲出，顯著降低促炎細(xì)胞因子的水平及促進(jìn)巨噬細(xì)胞對凋亡中性粒細(xì)胞的吞噬[12]。近幾年新研究發(fā)現(xiàn)，RvDl和人工合成的類似物被稱為全新的“促炎癥消退”治療的代表性藥物之一[13]。經(jīng)過體外、內(nèi)研究分析也已經(jīng)明確指出RvDl具有抗炎、促炎的作用[14]。且能抑制炎癥細(xì)胞的滲出、趨化及炎癥介質(zhì)的生成，加速傷口的愈合[15-16]。

本實驗研究顯示，大鼠皮下膿腫模型建立后各組的RvDl與空白組相比，表達(dá)水平較低。在應(yīng)用紅腫消酊的預(yù)治療組與治療組對RvDl含量的表達(dá)呈不斷增長勢態(tài)，表達(dá)量逐漸增加，與模型組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義。提示箍圍法（紅腫消酊）可以通過提高RvDl水平起到抗炎、止痛等促腫脹局限、護(hù)場形成的作用。

作為抑制炎癥相關(guān)因子BPI、RvDl，在感染傷口愈合中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，在皮下感染過程中，應(yīng)用箍圍藥紅腫消酊可提高機(jī)體內(nèi)BPI、RvDl的含量水平，以達(dá)到抑制炎癥、控制感染的作用，從而促使膿腫局限，加速護(hù)場的形成。本實驗中其BPI、RvD1兩大抗炎因子為箍圍藥紅腫消酊治療皮膚膿腫提供了一定的理論依據(jù)，但是我們?nèi)孕枭钊胙芯抗繃庵畏ㄕ{(diào)節(jié)BPI及RvDl含量變化的作用機(jī)制，提供進(jìn)一步的實驗研究及數(shù)據(jù)以證實其在臨床中的價值和意義，同時也為瘡瘍疾病的治療提供了一個新的方向和科學(xué)依據(jù)。

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（收稿：2016-10-26 修回：2017-07-06）

（責(zé)任編輯 田在善）

Effect of the Method of“Hoop Circumference”on Plasma Bactericidal/Permeability Increasing Protein and Resolvin D1 in Rats with Skin Abscess

WANG Wan-ying，ZHU Chao-jun，XU Qiang，et al.
Gradu?ate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin(300193),China

Objective To observe the effect of external use of encircling drugs Hongzhongxiao tincture on the expression of Bactericidal/permeability-increasing protein(BPI)and resolvin D1(RvD1)in plasma of rats with skin abscess. Methods Forty rats were divided into blank group,model group,control group,pretreat?ment group and treatment group.Except for blank group,the remaining 4 groups were induced subcutaneous ab?scess by staphylococcus aureus subcutaneous injection.The model group was given saline gauze dressing,the control group was given mupirocin ointment dressing on 3 days after the injection of bacteria while hard swelling emerging,the pretreatment group was dressed with Hongzhongxiao tincture 2 mL at 4 hours after the injection of bacteria,the treatment group was dressed with Hongzhongxiao tincture 2 mL after 3 days of injection of bacteria. Drug range should be 1 cm more than the swelling range,once a day.At the treatment of 3 d,7 d,14 d,and 18 d,heart bloods(2 mL)were collected,and the contents of BPI and RvDl in plasma were detected using ELI?SA method. Results In addition to the blank group,the contents of BPI and RvDl in plasma was increased in other 4 groups.In the Hongzhongxiao tincture treatment at 3 d and 7 d,the contents of BPI increased obviously in the pretreatment group.In the treatment group at 7 d,the content of BPI was significantly higher than that in the model group,with statistically difference[（247±27.89)ng/L vs(225±13.75）ng/L，P＜0.05].At 14 d and 18 d,plasma BPI content decreased gradually.Compared to the control group,the level of plasma BPI content in the pretreatment group was decreased significantly.The RvDl contents showed increasing tendency during the treatment period.At treatment of 14 d,the content of RvDl in pretreatment group[（2.11±0.24）ng/mL]and treat?ment group[（2.10±0.23）ng/mL]was higher that in the model group[（1.76±0.20）ng/mL](P＜0.05).At treatment of 18 d,the content of RvDl in pretreatment group[（2.17±0.27）ng/mL],treatment group[（2.27±0.26）ng/mL] was significantly increased than that in model group[（1.74±0.19）ng/mL]. Conclusion The treatment of rat skin abscess with Hongzhongxiao tincture can effectively improve the contents of BPI and RvDl in plasma.Thus, it plays the role of analgesia,anti-inflammatory,inhibiting edema,and,promote the formation of the protective field,accelerate the healing of sores.

“Defended field”theory;method of“hoop circumference”;hong zhong xiao;bactericidal/perme?ability-increasing protein;resolvin D1

Q95-33；R285.5

：A

：1007-6948(2017)04-0385-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.013

國家自然科學(xué)基金面上項目（81273759）

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（天津 300193）

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（天津 300150）

張朝暉，E-mail:zzh45@aliyun.com