基于肺與大腸相表里的“腸病及肺”動物模型制備

張淑坤，張艷敏，崔乃強(qiáng)

實驗研究

基于肺與大腸相表里的“腸病及肺”動物模型制備

張淑坤，張艷敏，崔乃強(qiáng)

目的：制備適用于研究“肺與大腸相表里”理論的“腸病及肺”大鼠模型。方法：20只SPF級雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，模型組采用腹腔注射人工胃液后2 h再注射大腸桿菌的方法制備的“腸病及肺”大鼠模型，造模后6 h測定大鼠肛溫，取全段結(jié)腸中的糞便用于結(jié)腸糞便含水量測定，取末端回腸和肺組織用于髓過氧化物酶(MPO)活性和病理學(xué)檢測。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠體溫升高，結(jié)腸糞便含水量減少,回腸和肺組織MPO活性增加（1.39±0.21 vs 0.72±0.16和1.51±0.26 vs 0.86±0.20，P＜0.05）；同時模型組大鼠顯微鏡下可見回腸絨毛排列紊亂、萎縮或脫落，肺間質(zhì)水腫、出血，部分肺泡塌陷、融合；透射電鏡下可見腸上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，線粒體嵴斷裂，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞胞漿濃縮，細(xì)胞核固縮，伴空泡化。結(jié)論：采用腹腔注射人工胃液后注射大腸桿菌的方法制備的“腸病及肺”大鼠模型，原發(fā)病在腹腔，同時具備腸和肺損傷，是研究“肺與大腸相表里”臟腑相關(guān)理論的一種合適的實驗動物模型。

肺與大腸相表里；腸病及肺；動物模型

肺和大腸氣機(jī)升降出入與氣化功能，維持肺的宣發(fā)和肅降，實現(xiàn)對呼吸運動、津液敷布、水液代謝和大腸傳導(dǎo)功能的有序調(diào)節(jié)?！胺闻c大腸相表里”語出《內(nèi)經(jīng)》，《靈樞·本輸篇》言：“肺合大腸，大腸者，傳導(dǎo)之府”[1]。肺為臟，屬陰；大腸屬腑，為陽。肺與大腸通過手太陰經(jīng)與手陽明經(jīng)的相互絡(luò)屬，在生理功能上的密切配合，構(gòu)成一組臟腑陰陽表理關(guān)系。為進(jìn)一步研究“肺與大腸相表里”理論及疾病“由腸及肺”的機(jī)理，我們設(shè)計并制備了基于腹腔感染的陽明腑實證大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心。動物許可證號為SCXK(軍)2009-003，體質(zhì)量（280±20）g。在動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及配制 髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒為南京建成生物公司產(chǎn)品。大腸桿菌菌株來自臨床腹膜炎病人，經(jīng)全自動微生物分析系統(tǒng)（VITEK-AMS)鑒定為大腸桿菌(生物號3001721278)。將大腸桿菌接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，生理鹽水沖洗菌苔，比濁法測定大腸桿菌濃度，配置濃度為2×109cfu/mL的細(xì)菌懸濁液。取10.5%鹽酸16.4 mL，胃蛋白酶（sigma公司）10 g，加生理鹽水至1000 mL，配制成pH=1.5的人工胃液。

1.3 動物模型制備 20只SPF級雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組。實驗前自由進(jìn)食水。制備大鼠重癥腹腔感染模型無菌條件下，取1 mL人工胃液于大鼠右下腹腔內(nèi)注入，2 h后按3∶1的比例右下腹腔內(nèi)注入2×109cfu/mL大腸桿菌加10% BaSO4營養(yǎng)肉湯0.9 mL，并在注射處按摩20 s，促進(jìn)吸收[2]。假手術(shù)組以等量蒸餾水取代人工胃液注入，2 h后同樣按3∶1的比例右下腹腔內(nèi)注入生理鹽水加10%BaSO4營養(yǎng)肉湯0.9 mL。造模后6 h，所有大鼠麻醉，測定肛溫，開腹開胸,取末端回腸和肺組織用于MPO活性和病理學(xué)檢測，取全段結(jié)腸中的糞便用于結(jié)腸糞便含水量測定。

1.4 結(jié)腸糞便重量和含水量測定 取全段結(jié)腸中的糞便,稱濕重后置于80℃烤箱中48 h，稱干燥后糞便重量(干重)。糞便含水量=（濕重-干重）/濕重× 100%。

1.5 回腸和肺組織HE染色 回腸和左肺下葉用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，3 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜和肺組織組織病理改變。

1.6 回腸和肺組織電鏡觀察 將回腸和肺組織切成1 mm厚左右小塊,置于2%預(yù)冷的戊二醛溶液固定24 h，磷酸緩沖液沖洗后2%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水,醋酸鈾塊染，苯二甲酸二丙烯脂滲透包埋,常規(guī)超薄切片，枸椽酸鉛染色，上鏡觀察并照相。

1.7 回腸和肺組織MPO活性 按試劑盒說明化學(xué)比色法測定，結(jié)果以U/g蛋白表示。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組大鼠豎毛、蜷縮、少動，無掙扎反抗，假手術(shù)組大鼠精神良好，活動自如，掙扎有力。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠進(jìn)食量減少，體溫升高幅度（△T=造模6 h體溫-造模時體溫）升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）

2.2 結(jié)腸糞便重量和含水量變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠結(jié)腸糞便含水量減少（P＜0.05，見表1）。

表1 兩組大鼠體溫、進(jìn)食量和結(jié)腸糞便含水量變化(±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05

組別假手術(shù)組模型組n 10 10△T（℃）0.44±0.09 1.14±0.13a進(jìn)食量（g）8.20±0.10 5.61±0.57a糞便含水量（%）63.28±6.18 45.06±5.22a

2.3 回腸組織病理學(xué)觀察 顯微鏡下可見模型組大鼠回腸絨毛排列紊亂、萎縮變短、部分上皮細(xì)胞脫落，固有層可見集合淋巴小結(jié)數(shù)量增多，固有層、伴黏膜下層、肌層和漿膜均可見少量炎細(xì)胞浸潤。假手術(shù)組回腸黏膜上皮排列有序，絨毛結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)大致正常(見圖1)。

2.4 肺組織病理學(xué)觀察 模型組大鼠肺間質(zhì)水腫、出血，肺泡壁斷裂，肺泡有塌陷、融合，肺泡腔內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤；假手術(shù)組大鼠肺血管、肺泡間質(zhì)和肺泡腔均未見明顯異常(見圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）

2.5 回腸組織超微病理改變 模型組腸上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，細(xì)胞間隙增寬；線粒體重度腫脹，嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張。細(xì)胞核固縮，核膜不整齊，可見凋亡細(xì)胞。假手術(shù)組腸上皮細(xì)胞間緊密連接排列整齊。線粒體豐富，無腫脹；細(xì)胞核呈橢圓形，核膜完整(見圖3)。

圖3 兩組大鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接及細(xì)胞形態(tài)改變

2.6 肺組織超微病理改變 模型組肺組織透射電鏡觀察，可見肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度形態(tài)學(xué)改變,包括細(xì)胞體積縮小變圓，細(xì)胞核呈不規(guī)則形，核被膜外折或內(nèi)陷，核固縮并邊集在核膜下呈月牙狀或腰帶狀，胞漿濃縮，胞漿內(nèi)嗜鋨性板層體減少，排空增多，伴空泡化。假手術(shù)組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常（圖4）。

2.7 回腸和肺組織MPO活性 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠回腸和肺組織MPO活性升高（P＜0.05，見表2）。

3 討論

陽明腑實證出自《傷寒論》，是指外邪人里化熱，與大腸的燥熱相合，以致津液被耗，燥結(jié)成實，阻滯于中，即產(chǎn)生潮熱、譫語、便秘、腹?jié)M而痛、脈沉實等證?！秱摗氛f：“陽明之為病，胃家實是也”。我們大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，在重癥急腹癥和嚴(yán)重腹內(nèi)感染時患者存在明顯的痞滿燥實的陽明腑實證候，如疾病不能得到很好的治療，將發(fā)生急性肺損傷甚至ARDS[3]。嚴(yán)重陽明腑實證能影響肺的肅降，若大腸熱結(jié)，上灼于肺，導(dǎo)致肺氣不降，可出現(xiàn)呼吸急迫，咳嗽氣喘。是為“肺與大腸相表里”理論中“腸病及肺”的病理過程[4-5]。

圖4 兩組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞超微病理改變

表2 兩組大鼠回腸和肺組織MPO活性變化（U/g，±s）

表2 兩組大鼠回腸和肺組織MPO活性變化（U/g，±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05

組別假手術(shù)組模型組n 肺10 10 MPO活性回腸0.72±0.16 1.39±0.21a0.86±0.20 1.51±0.26a

一些學(xué)者對陽明腑實證和“肺與大腸相表里”理論有所研究，但均缺乏“證”和能導(dǎo)致肺腸臟腑相關(guān)的模型。在制備中醫(yī)“證”的動物模型中，應(yīng)保證符合“證”的癥候，并注意導(dǎo)致“證”產(chǎn)生的病因[2,6-7]。“腸病及肺”動物模型應(yīng)滿足原發(fā)病在腸（腹腔），并同時具備腸和肺組織損傷兩個基本條件[8-9]。以三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇相結(jié)合的方法誘導(dǎo)實驗性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，觀察到腸病大鼠呼吸道和腸道的部分菌群出現(xiàn)同步增多或減少的相關(guān)性變化,提示微生態(tài)菌群的變化可能是"腸病及肺"的發(fā)病機(jī)制之一[10]。我們采用模擬潰瘍病穿孔病理過程和臨床特征的方法制作“腸病及肺”大鼠模型，對傳統(tǒng)腹腔注射大腸桿菌方法進(jìn)行改進(jìn)，先經(jīng)腹腔注射人工胃液，造成化學(xué)性腹膜炎，之后再注射來自化膿性闌尾炎分離、鑒定的大腸桿菌，形成細(xì)菌性腹膜炎。依此法制備的疾病模型，較盲腸結(jié)扎穿刺法形成的腹膜炎模型重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，病理證實同時具有腸黏膜屏障破壞和肺組織損傷，電鏡觀察進(jìn)一步明確，腸黏膜屏障破壞以回腸上皮細(xì)胞壞死為主要特征，肺組織損傷以Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞壞死為主。

MPO是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，可用于評估中性粒細(xì)胞浸潤程度。“腸病及肺”大鼠回腸和肺MPO活性升高，說明組織中性粒細(xì)胞增多，回腸和肺組織炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。我們還同時發(fā)現(xiàn)模型組大鼠豎毛、蜷縮少動，腹脹、進(jìn)食減少，體溫升高，結(jié)腸糞便含水量減少，說明大鼠有痞滿燥實堅等表現(xiàn)，符合陽明腑實證。

本文采用腹腔注射人工胃液后注射大腸桿菌的方法制備的“腸病及肺”大鼠模型，不僅體現(xiàn)了原發(fā)病在腸（腹腔），同時還伴有腸和肺的組織病理學(xué)損傷和炎性反應(yīng)增強(qiáng)，為進(jìn)一步研究“肺與大腸相表里”臟腑相關(guān)理論提供了可靠的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

[1]于立文.黃帝內(nèi)經(jīng)[M].沈陽:遼海出版社,2010：493.

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（收稿：2017-01-16 修回：2017-03-20）

（責(zé)任編輯 田在善 屈振亮）

Preparation of a Model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”in Rats Based on the Theory of“Exterior and Interior Relationship between Lung and Large Intestine”

ZHANG Shu-kun, ZHANG Yan-min,CUI Nai-qiang
Tianjin Institute of Acute Abdominal Diseases of Intergrated Traditional Chi?nese and Western Medicine,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To prepare a model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”in rats which suitable for research the theory of“Exterior and Interior Relationship between Lung and Large Intestine”. Methods SPF male Wistar rats(n=20)were randomly divided into sham-operation group and model group. The model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”was prepared by intraperitoneal injection of artificial gastric juice and Escherichia coli.At 6 h after modeling,the rectal temperature and the water content in the whole colon fecal were measured;the MPO activity and the histopathological changes of ileum and lung were examination. Results Compared with sham operation group,the body temperature of rats in model group was increased,the water content of colon fecal was decreased,and the MPO activity of ileum and lung was in?creased(1.39±0.21 vs 0.72±0.16 and 1.51±0.26 vs 0.86±0.20，P＜0.05).Microscopically,the ileal villi of the model group were disorganized,atrophic or detached,the alveolar septa became markedly damaged and the fu?sion of alveoli appeared.Transmission electron microscopy showed that the tight junctions between intestinal epi?thelial cells were disrupted,the mitochondrial cristae were broken.In alveolar type II epithelial cell of the model group,cytosolic concentration,pyknosis,and vacuolization were observed. Conclusion The rat model of“Large Intestine Disease Causing Pulmonary Disease”is a suitable model to research the theory of“Exterior and Interior Relationship between Lung and Large Intestine”.

Exterior and interior relationship between lung and large intestine;large intestine disease caus?ing pulmonary disease;animal model

Q95-34;R655.3

：A

：1007-6948(2017)04-0373-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.010

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2009CB522700）

天津市南開醫(yī)院急腹癥研究所（天津 300100）

崔乃強(qiáng)，E-mail:nctsui@126.com