UPLC-MS/MS法測定電子煙煙油中TSNAs的含量

陳國輝，李映梅，董勝強(qiáng)，楊 燕，侯 英

(1.云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司，云南 昆明 650106；2.云南同創(chuàng)檢測技術(shù)股份有限公司，云南 昆明 650106)

UPLC-MS/MS法測定電子煙煙油中TSNAs的含量

陳國輝1，李映梅2*，董勝強(qiáng)2，楊 燕2，侯 英2

(1.云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司，云南 昆明 650106；2.云南同創(chuàng)檢測技術(shù)股份有限公司，云南 昆明 650106)

為快速準(zhǔn)確測定電子煙煙油中的煙草特有亞硝胺(TSNAs)，對前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，建立了煙油中TSNAs的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法，結(jié)果表明：使用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，可以很好地去除雜質(zhì)干擾； NNK、NNN、NAT、NAB的檢出限為0.005～0.020 ng/g，定量限為0.015～0.067 ng/g，3個加標(biāo)水平的回收率為85.16%～105.79%；通過對6個不同品牌電子煙煙油中TSNAs的測定，NNN的檢出率和含量是最低的，因此，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，適用于測定電子煙煙油中TSNAs的含量。

UPLC-MS/MS;TSNAs;HLB固相萃取;電子煙煙油

自2004年電子煙發(fā)明以來，全球抽吸電子煙的人數(shù)都呈現(xiàn)快速增長的趨勢[1-3]，電子煙的品質(zhì)和安全性等問題日益凸顯[4-7]，各個國家也開始對電子煙進(jìn)行了監(jiān)管和相關(guān)的研究[8]。2016年5月5日，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)發(fā)布了有關(guān)電子煙的新規(guī)定，將電子煙視同為煙草產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管。

電子煙又名電子煙堿傳送系統(tǒng)，電子煙的煙堿幾乎都是從煙草中提取的，而TSNAs是在煙草調(diào)制和儲存過程中由亞硝酸鹽與煙草生物堿反應(yīng)形成的[9-13]，TSNAs會引起動物鼻腔、肝、胰等組織的癌變[14-15]，對人體危害極大。TSNAs的含量極低、基質(zhì)干擾大，給定量分析帶來了一定的難度[16-18]。相關(guān)專利和文獻(xiàn)報道電子煙煙油中NNK、NNN、NAT、NAB含量的測定可采用GC-MS法[9]、LC-MS/MS法[17]、RP-GC-TEA法(基質(zhì)固相分散-氣相色譜熱能檢測法)[19]。實(shí)驗(yàn)室根據(jù)實(shí)際情況，建立了UPLC-MS-MS準(zhǔn)確測定電子煙煙油中的TSNAs的方法，試圖通過對電子煙煙油中TSNAs含量進(jìn)行對比，為準(zhǔn)確客觀評價電子煙油中TSNAs含量情況提供技術(shù)手段，對電子煙安全性的評價具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇(色譜純，Dikma)；乙腈(色譜純，Dikma)；乙酸(分析純)；甲酸(分析純)；超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)；乙酸銨(分析純)；氘代-4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl-d4)-1-butanone(NNK-d4，純度≥99%)；氘代-N-亞硝基降煙堿，rac N′-Nitrosonornicotine-d4(NNN-d4，純度≥99%)；N-亞硝基假木賊堿，(R,S)-N-Nitrosoanabasine(NAB純度≥98%)；N-亞硝基新煙堿，(R,S)-N-Nitrosoanatabine(NAT，純度≥98%)；4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK，純度≥98%)；N-亞硝基降煙堿，rac N′-Nitrosonornicotine(NNN，純度≥98%)；色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；固相萃取柱：Oasis HLB(60 mg/3 mL，美國Waters公司)；高純氮?dú)?純度大于99.999%)。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：1290高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Agilent 6460三重四級桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國Agilent公司)；分析天平(瑞士梅特勒，型號：AB204-S，感量0.1 mg)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 各稱取約10.0 mg的NNK-d4和NNN-d4，用甲醇完全溶解后，分別轉(zhuǎn)移至2個10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。分別移取1.0 mL NNK-d4和NNN-d4的1.0 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為10.0 μg/mL的NNK-d4和NNN-d4一級混合內(nèi)標(biāo)溶液。該溶液于-18 ℃條件下避光保存，有效期為6個月。

各稱取約10.0 mg的NAB、NAT、NNK、NNN，用甲醇完全溶解后，分別轉(zhuǎn)移至4個10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。該儲備液于-18 ℃條件下避光保存，有效期為6個月。

1.2.2 樣品處理與分析 準(zhǔn)確稱取0.2～0.5 g樣品于錐形瓶中，加入5.0 mL去離子水，準(zhǔn)確加入200 μL 100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1 min，超聲5 min，1000 r/min離心5 min，上清液待凈化，Oasis HLB固相萃取小柱預(yù)先依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，將上清液全部倒入固相萃取小柱中，待樣品溶液自然流盡后，用3 mL 2%甲醇水溶液淋洗，最后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL濃度為0.1 mol/L的乙酸銨溶液超聲溶解，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，待測定。

高效液相色譜參考條件：色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A：甲醇，流動相B：0.1%的乙酸溶液,梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜參考條件：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓：5000 V；各分析物質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

表2 TSNAs及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜檢測參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 萃取方式的優(yōu)化 目前，常用的提取凈化方法為直接使用乙酸銨水溶液過濾進(jìn)樣，筆者驗(yàn)證了該方法，這種方法對于添加了煙草提取物的煙油凈化不足，有很大的基質(zhì)干擾，定量和定性都不準(zhǔn)確。在CORESTA建議的方法中，水溶液提取后，使用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，在驗(yàn)證該方法后，對雜質(zhì)有較強(qiáng)的去除效果，因此選擇該方法作為提取凈化電子煙煙油方法。

2.1.2 萃取時間的優(yōu)化 加入水提取時間設(shè)定為0、5、10、15、30 min，考察不同提取時間對提取效果的影響。結(jié)果表明，超聲5 min后檢測結(jié)果并沒有變化，因此，選擇5 min作為超聲時間。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關(guān)系和檢出限 配制濃度為0.20～50 ng/mL系列濃度的TSNAs標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，得到TSNAs積分峰面積，以峰面積作為縱坐標(biāo)，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對校正數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

檢測器產(chǎn)生的響應(yīng)信號為噪聲值3倍時的量為檢出限，檢測器產(chǎn)生的響應(yīng)信號為噪聲值10倍時的量為定量限，并通過定容體積和樣品量換算得到樣品的檢出限和定量限，具體見表3。

從表3可以看出，TSNAs的相關(guān)系數(shù)大于0.999，表明在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限和定量限較低，說明該方法的檢出限和定量限低于文獻(xiàn)報道的數(shù)值，因此，該方法有較好的靈敏度、較低的檢測限，能夠很好地滿足檢測的要求。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

注:線性方程中的A為峰面積，C為各組分的濃度，單位為ng/mL。

表4 TSNAs的重現(xiàn)性結(jié)果

2.2.2 重復(fù)性與重現(xiàn)性 選取樣品稱取6次，樣本進(jìn)行前處理，測定TSNAs含量，在相同條件下進(jìn)行3 d的測定，其日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。由表4可知，該方法的連續(xù)3 d的RSD在2.10%～8.69%之間，3 d的RSD分別為6.28%、6.08%、5.42%和7.50%，說明該方法對TSNAs的測定具有較好的重現(xiàn)性。

2.2.3 回收率 采用加入TSNAs標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)低、中、高3個梯度(20、50、200 ng/g)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，每個濃度平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，分別得到了TSNAs的回收率(表5)。由表5可知，建立的分析方法回收率86.74%～105.79%，滿足電子煙煙油中TSNAs含量的檢測要求。

2.3 樣品檢測

采集了市場中的6種煙油進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表6，對實(shí)際樣品進(jìn)行了TSNAs檢測，4種TSNAs含量都較低，表明這可能與該煙油配方中加入煙草提取物含量有關(guān)。TSNAs在樣品中均有不同程度的檢出，NNN的檢出率和含量均是最低的，該規(guī)律類似于煙草制品[20]。

表5 TSNAs的加標(biāo)回收率

表6 6個電子煙油樣品中TSNAs檢測結(jié)果 ng/g

注:N.D表示未檢出或低于檢出限。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室通過優(yōu)化前處理，選擇HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定電子煙煙油中TSNAs的方法。得出以下結(jié)論：(1)檢出限和定量限較低、重現(xiàn)性較好、回收率較好，能夠滿足電子煙煙油中TSNAs含量的檢測要求；(2)通過對實(shí)際樣品的檢測，NNN的檢出率和含量均是最低的，這個規(guī)律類似于煙草及煙草制品。

[1] Etter J F, Bullen C, Flouris A D, et al. Electronic nicotine delivery systems: a research agenda[J]. Tobacco Control, 2011, 20(3): 243-248.

[2] 李長昱,李明,陳麗珠.關(guān)于專利數(shù)據(jù)的國內(nèi)外新型煙草制品發(fā)展情況分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(11):350-351.

[3] 劉亞麗,洪群業(yè),鄭路,等.無煙氣煙草制品技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢研究[J].中國煙草學(xué)報,2014,21(3):134-139.

[4] 仇高賀.電子香煙結(jié)構(gòu)、功能及出口現(xiàn)狀研究[J].中國科技信息,2010(10)：132-133.

[5] Michael L T, Wei Y, Michael E H, et al. Analysis of electronic cigarette cartridges, refill solutions and smoke for nicotine and nicotine related impurities[J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 2011, 34(14): 1442-1458.

[6] Lauterbach J H, Laugesen M, Ross J D. Suggested protocol for estimation of harmful and potentially harmful constituents in mainstream aerosols generated by electronic nicotine delivery systems[R]//Poster 1860 presented at the 51st annual meeting of the Society of Toxicology in San Francisco, 2012.

[7] 蔣舉興,者為,詹建波，等.電子煙的發(fā)展現(xiàn)狀及其危害性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(16):7322,7353.

[8] 趙偉,張鳳梅,吳億勤,等.一種電子煙煙霧中TSNAs的測定方法：中國，1104237431A[P].2014-12-24.

[9] 羅彥波,陳小靜,姜興益,等.一種電子煙煙液中煙草特有N-亞硝胺的測定方法：中國，105158392A[P].2015-12-16.

[10] 王浩雅，楊帥，王理珉，等.調(diào)制技術(shù)對曬黃煙煙葉中TSNAs影響的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27(6):76-79.

[11] Djordievic M V, Brunemann K D, Hoffmann D. Identification and analysis of a nicotine-derived N-nitrosamino acid and other nitrosamino acids in tobacco[J]. Carcinogenesis, 1989, 10(9): 1725-1731.

[12] 朱風(fēng)鵬,趙明月,胡清源,等.TSNAs的形成、影響因素、分析及清除方法綜述[J].煙草科技,2004(7):27-30.

[13] 施應(yīng)選.煙葉和煙氣中TSNAs的含量分析及其前體物的關(guān)系[D].昆明：云南師范大學(xué),2006:19-24.

[14] Hecht S S, Hatsukami D K, Bonilla L E, et al. Quantitation of 4-oxo-4-(3-pyridyl)butanoic acid and enanti-omers of 4-hydroxy-4-(3-pyridyl) butanoic acid in human urine; a substantial pathway of nicotine metabolism[J]. Chem Res Toxicol, 1999, 12(2): 172-179.

[15] 朱文靜,楊俊,劉百戰(zhàn),等.UPLC-MS/MS對卷煙煙氣中4種煙草特有亞硝胺的快速測定[J].分析測試學(xué)報,2010,29(7):26-30.

[16] Shi H, Wang R, Bush L P, et al. Changes in TSNA contents during tobacco storage and the effect of temperature and nitrate level on TSNA formation[J]. J Agric Food Chem, 2013, 61(47): 11588-11594.

[17] 陳霞,金立鋒,劉萍萍,等.UPLC-MS/MS法同時測定煙葉中的TSNAs[J].煙草科技,2016,49(3):62-67.

[18] 張小濤,韓書磊,陳歡,等.一種電子煙煙液中煙草特有亞硝胺液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法：中國，103837633A[P].2014-06-04.

[19] 張鳳梅,楊光宇,劉志華,等.基質(zhì)固相分散-氣相色譜熱能檢測法測定電子煙煙油中的TSNAs[J].現(xiàn)代化工,2016(6):191-194.

[20] 王保興,汪旭,王玉,等.烤煙中煙草特有亞硝胺的對比[J].煙草科技,2010(11):47-50.

(責(zé)任編輯：曾小軍)

Determination of Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNAs) Content in Electronic Cigarette Liquid by Using UPLC-MS/MS Method

CHEN Guo-hui1, LI Ying-mei2*, DONG Sheng-qiang2, YANG Yan2, HOU Ying2

(1. Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Limited Company, Kunming 650106, China; 2. Yunnan Comtestor Detection Technology Limited Company, Kunming 650106, China)

An improved method was developed to rapidly and accurately determine four kinds of tobacco-specific N-nitrosamines (TSNAs) in electronic cigarette liquid by using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method. The results showed that using HLB solid-phase extraction column could well purify the TSNAs in electronic cigarette liquid. The limit of detection for NNK, NNN, NAT and NAB in samples was 0.005～0.020 ng/g, and the limit of their quantification ranged from 0.015 ng/g to 0.067 ng/g. The recovery of 3 analytes varied from 85.16% to 105.79%. This method was used for the determination of TSNAs content in the liquid of 6 brands of electronic cigarette, and it was found that both the detection rate and the content of NNN were the lowest. Therefore, this method is stable and accurate, and it is suitable for the determination of TSNAs content in liquid of electronic cigarette.

UPLC-MS/MS; TSNAs; HLB solid-phase extraction; Electronic cigarette liquid

2017-04-27

陳國輝(1983─)，男，山東聊城人，工程師，碩士研究生，從事卷煙及其制品的研究和檢測工作。*通訊作者：李映梅。

O657.63

A

1001-8581(2017)08-0110-04