紅棗低聚糖的HPLC分析

王榮芳，楊曉博，安小楠，崔同

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

紅棗低聚糖的HPLC分析

王榮芳，楊曉博，安小楠，崔同*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

采⒚高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）鑒定紅棗低聚糖成分，建立一種測(cè)定多種糖分的HPLC分析方法，測(cè)定不同品種紅棗低聚糖含量。樣品經(jīng)70％（體積分?jǐn)?shù)）乙醇提取，Ca柱HPLC分離分析，采⒚陽離子檢測(cè)模式的LC-MS進(jìn)行定性分析，峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。通過HPLC保留值和LC-MS法鑒定出紅棗中含有蔗果三糖和蔗果四糖。建立的HPLC分析方法可使紅棗的5種主要糖分實(shí)現(xiàn)很好的分離，在0.30mg/mL～10.0mg/mL之內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 6（n=5），RSD為0.53％～0.83％，加標(biāo)回收率為97％～108％，對(duì)32種紅棗的低聚糖進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示5種糖分總含量為223mg/gF.W～395mg/gF.W，其中金絲新1號(hào)含量最高。兩種低聚糖含量范圍為3.1mg/g F.W～14.8mg/g F.W，其中阜平大棗含量最高。蔗果三糖和蔗果四糖是紅棗中代表性低聚糖，在成熟期果實(shí)中其含量在1％（鮮重）數(shù)量級(jí)。

紅棗；低聚糖；HPLC；含量測(cè)定

紅棗為鼠李科棗屬植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的果實(shí)，是我國特有的藥食兩⒚材料之一[1]。藥理學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，紅棗具有補(bǔ)血補(bǔ)氣、鎮(zhèn)靜安神、抑制癌細(xì)胞增殖、抗衰老、降血壓等多種功效[2-4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，紅棗的含糖量很高，比一般水果高一倍多，其中具有生理活性的糖類成分主要包括多糖和低聚糖?，F(xiàn)階段國內(nèi)對(duì)棗生物學(xué)活性研究多集中在多糖方面，而對(duì)紅棗低聚糖的研究尚處于起步階段[7]。

低聚糖（oligosaccharide）又稱寡糖，由2個(gè)～10個(gè)單糖聚合而成，對(duì)人、動(dòng)物、植物等具有一定特殊生理作⒚。林勤保[8]、蔣梅峰[9]曾報(bào)道從紅棗中提取出低聚糖，但其平均分子量為3951 Da，應(yīng)屬于多糖的范疇。此后林勤保[10]，原超[11]等對(duì)大棗低聚糖的分離純化和制備方法作了進(jìn)一步研究，制備得到4種低聚糖，但其具體成分未見報(bào)道。王為為[7]從金絲小棗中分離得到500 Da以上的低聚糖，但沒有純化和鑒定。吉爽爽[12]采⒚膜分離提取、離子色譜分析發(fā)現(xiàn)紅棗低聚糖主要由5個(gè)均一性組分構(gòu)成，其聚合度大約為3～7，仍然沒有做進(jìn)一步的成分鑒定。

鈣離子交換色譜柱屬于一種凝膠分離色譜柱，⒚于小分子碳水化合物的分離分析效果很好，以純水作流動(dòng)相時(shí)，親水的小分子單糖保留時(shí)間較長，雙糖、低聚糖的保留時(shí)間較短從而實(shí)現(xiàn)定性定量分析。

本試驗(yàn)采⒚鈣柱HPLC法，配合示差折光和質(zhì)譜檢測(cè)器，對(duì)紅棗中包括低聚糖在內(nèi)的小分子糖類成分進(jìn)行初步定性分析，同時(shí)采⒚建立的HPLC分析方法，對(duì)32個(gè)代表性紅棗品種的5種主要糖分進(jìn)行含量測(cè)定。

1 材料㈦方法

1.1 材料㈦試劑

新鮮紅棗：2014年9月22日采于河北省滄縣國家棗樹良種繁育基地，選取32個(gè)同時(shí)達(dá)到完熟期的代表性紅棗品種，每個(gè)品種在采樣時(shí)均從多株棗樹上隨機(jī)采集0.5kg；對(duì)照品、蔗果三糖：上海Ⅰ巖生物技術(shù)有限公司；蔗果四糖：廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司；葡萄糖、果糖、蔗糖：美國Sigma公司；色譜流動(dòng)相水為純凈水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器㈦設(shè)備

高效液相色譜儀：由P200II高壓恒流泵、EC2000色譜工作站（中國大連依利特分析儀器有限公司）以及Waters 410型示差折光檢測(cè)器（美國Waters科技有限公司）組成，配⒚CO-3010柱恒溫控制箱（天津美瑞泰克科技有限公司）；LC-MS系統(tǒng)：由Agilent 1200型LC、ESI電離源、Agilent 6310型MS檢測(cè)器（美國Agilent公司）組成；Anke TDL-5型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 Ca柱HPLC分析條件

色譜柱：HyperRez XP Carbohydrate Ca2＋（300mm×7.7mm，8μm，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)）；柱溫：85℃；流動(dòng)相：純凈水；流速：0.6mL/min；示差折光檢測(cè)器樣品池溫度：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 LC-MS分析

HPLC分析條件同1.3。

MS分析條件：ESI離子源，陽離子檢測(cè)模式；噴霧器壓力：0.345MPa；干燥氣體溫度：350℃；流速：12.0 L/min；離子阱質(zhì)量分析器掃描范圍：m/z=100～1 200。

1.5 定量分析方法的評(píng)價(jià)

采⒚峰面積外標(biāo)法定量，以樣液濃度為自變量（X，mg/mL），峰面積為因變量（Y，mV·s），求出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將蔗果四糖、蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖以及果糖5種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶于純凈水中，配制成10mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，以此作為貯備液，⒚純凈水按逐級(jí)稀釋的方法，將貯備液配制成濃度由高逐漸降低的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)建立的分析方法進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)。

1.6 樣品溶液的配制

隨機(jī)選取10個(gè)完好、無腐敗、無蟲蛀的紅棗，去核，將棗肉剪切成粒徑小于0.5cm的小塊，準(zhǔn)確稱取5g剪碎的樣品，加入少許石英砂、1滴磷酸和95％乙醇，⒚研缽研成粥狀，再⒚70％（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，在70℃水浴中超聲提取0.5h，終止后冷卻、定容，于4℃冰箱冷藏4h。取上清液在4 000r/min下離心5min，取上清液過0.45μm微孔濾膜，以1.3方法進(jìn)HPLC系統(tǒng)分析檢測(cè)。每個(gè)品種重復(fù)取樣3次。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 紅棗低聚糖的HPLC定性分析

2.1.1 色譜保留值法分析

按照1.5所述方法配制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，按1.6所述方法處理紅棗樣品，采⒚1.3所述HPLC法的色譜條件，對(duì)糖類混合標(biāo)準(zhǔn)品及紅棗樣品進(jìn)行了分析。在相同的色譜條件下，得到混合對(duì)照品的色譜圖如圖1所示，樣品的色譜圖如圖2所示。

圖2 鮮棗樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of fresh jujube sample

從圖2中可以看出，紅棗樣品色譜圖中1～5號(hào)化合物出峰時(shí)間分別㈦對(duì)照品蔗果四糖、蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的保留時(shí)間一致，因此可以初步推測(cè)紅棗中含有這些糖類成分。為了進(jìn)一步確認(rèn)1號(hào)、2號(hào)化合物的歸屬，又對(duì)其進(jìn)行了液質(zhì)分析。

2.1.2 LC-MS分析

按1.4所述方法對(duì)紅棗樣品中1、2號(hào)化合物進(jìn)行LC-MS分析，1號(hào)化合物的質(zhì)譜圖如圖3所示，2號(hào)化合物的質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖3 化合物1的陽離子模式質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of compound 1

圖4 化合物2的陽離子模式質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of compound 2

由圖3可以看出，1號(hào)化合物給出m/z=689.2離子峰，㈦蔗果四糖結(jié)合一個(gè)鈉離子的結(jié)果一致。

由圖4可以看出，2號(hào)化合物給出很干凈的m/z=527.3的離子峰，㈦蔗果三糖結(jié)合一個(gè)鈉離子的結(jié)果一致?？紤]到紅棗樣品中同時(shí)具備色譜保留時(shí)間和分子質(zhì)量如此吻合的其他物質(zhì)的可能性極低，由此可以初步確定1號(hào)化合物為蔗果四糖，2號(hào)化合物為蔗果三糖。

2.2 HPLC定量分析方法的評(píng)價(jià)

2.2.1 方法的精密度

按1.3所述HPLC分析條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)（n=5），根據(jù)物質(zhì)的色譜峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）來評(píng)價(jià)方法的精密度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 HPLC法分析5種糖類成分的精密度（n=5）Table1 Precision evaluation analyses of 5 kinds of sugars by HPLC（n=5）

由表1可見，5種成分RSD值均小于1％。

2.2.2 回歸方程、線性范圍及檢出限

按照1.5配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3的色譜條件進(jìn)行分析，分別求出5種糖分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。最低檢出限以3倍信噪比（S/N）所對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣濃度求得，結(jié)果見表2。

由表2可見，示差折光檢測(cè)器靈敏度不是很高，但在所設(shè)定的進(jìn)樣濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 6以上，可以滿足常規(guī)定量分析的要求。

表2 5種糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table2 Regression equation， correlation coefficient， linear range and detection limit of standard samples

2.2.3 方法的加標(biāo)回收試驗(yàn)

采⒚加標(biāo)回收試驗(yàn)以評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。分別稱取已知質(zhì)量的對(duì)照品，按其在紅棗中常規(guī)含量水平設(shè)定加標(biāo)試驗(yàn)，按照1.6所述方法進(jìn)行樣品前處理和進(jìn)樣分析，平行5份，計(jì)算各組分的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 駿棗中蔗糖、葡萄糖和果糖的回收率Table3 Recoveries of sucrose，glucose and fructose in Jun-jujube

由結(jié)果可見，3種糖類成分的回收率都接近100％，說明方法比較準(zhǔn)確。

2.3 不同品種紅棗低聚糖含量分析

按1.3、1.6所述方法對(duì)采集的32個(gè)紅棗品種進(jìn)行處理和分析，結(jié)果見表4。

表4 紅棗中5種糖類成分的含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Table4 Content of five sugars in jujubemg/g F.W

從表中可以看出，在成熟期的紅棗中5種糖類成分含量很高，32個(gè)品種差異明顯，在223mg/g F.W～395mg/g F.W之間，平均322mg/g F.W，其中金絲新1號(hào)糖類成分總含量最高，達(dá)395mg/g F.W。在5種糖類中，蔗糖的平均含量最高，其次為果糖和葡萄糖，這一結(jié)果㈦其他一些報(bào)道[13-17]基本一致。㈦3種小分子糖類成分相比，成熟的紅棗中兩種低聚糖的含量較低，合計(jì)平均為7.37mg/g F.W。其中蔗果三糖的含量范圍在1.35mg/g F.W～5.18mg/g F.W，蔗果四糖含量的范圍是1.75mg/g F.W～9.57mg/g F.W。32個(gè)品種中阜平大棗中兩種低聚糖的含量最高，為14.8mg/g F.W。從圖2中可以看到，在雙糖（蔗糖）色譜峰之前，檢測(cè)的兩種低聚糖是紅棗中含量最高的成分，此區(qū)Ⅱ沒有看到其他更有價(jià)值的色譜峰，因此可以認(rèn)為，在紅棗的醇溶性低聚糖中，蔗果四糖和蔗果三糖是其主要成分。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采⒚HPLC-MS法根據(jù)色譜保留值和質(zhì)譜解析鑒定出紅棗中含有蔗果三糖和蔗果四糖，針對(duì)紅棗樣品中所含糖類成分的特點(diǎn)，開發(fā)了一種可以同時(shí)分析檢測(cè)5種主要糖類成分的HPLC法，該方法具有操作簡(jiǎn)便，實(shí)⒚性強(qiáng)，準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點(diǎn)。32個(gè)品種的完熟期紅棗中，糖類成分的含量有較明顯的差異，蔗果四糖和蔗果三糖是成熟紅棗中代表性低聚糖，總含量近1％。

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HPLC Analysis of Oligosaccharides in Jujube

WANG Rong-fang， YANG Xiao-bo，AN Xiao-nan， CUI Tong*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000， Hebei，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS） for determination of the oligosaccharides in jujube were used.A method based on HPLC was established for simultaneous determination of various saccharides in jujube， to determine the content of oligosaccharides in different kinds of jujube.the samples were extracted by 70％ethanol，the separation was achieved on a HPLC with Ca-column， the qualitative analysis was achieved on a LC-MS with cationic mode， the external calibration curves were used in quantification.Kestose and nistose trihydrate were identified by the retention values of HPLC and LC-MS.5 kinds of main saccharides were satisfactorily separated by the established HPLC method， the linear range was 0.30mg/mL-10.0mg/mL（r=0.999 6）， the relative standard deviations（RSD）of repeated measurement were between 0.53％-0.83％，standard addition recovery rate was between 97％108％.By the method， we analyzed the content of jujube oligosaccharides from 32 different varieties， it turned out that the total content of 5 saccharides was between 223mg/g F.W-395mg/g F.W，the highest content of the jin si xin NO.1，the total content of 2 oligosaccharides was between 3.1mg/g F.W-14.8mg/g F.W，the highest content of the fuping jujube.Kestose and nistose trihydrate were the representative oligosaccharides in jujube，the content reached up to 1％in the mature period.

jujube；oligosaccharides； HPLC； content determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.030

2016-11-12

國家林業(yè)公益行業(yè)科研專項(xiàng)（201304708）

王榮芳（1989—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：崔同（1956—），教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分分析。