外周血中Th17/Treg細(xì)胞及炎癥因子水平與宮頸病變程度、HPV危險(xiǎn)分型的關(guān)系

樊金焱，劉玉玲，邰國香，孫選，楊德勝

(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033)

·臨床研究·

外周血中Th17/Treg細(xì)胞及炎癥因子水平與宮頸病變程度、HPV危險(xiǎn)分型的關(guān)系

樊金焱，劉玉玲，邰國香，孫選，楊德勝

(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033)

目的 探討外周血輔助性T17細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg細(xì)胞)及炎癥因子水平與宮頸病變程度、人乳頭瘤狀病毒(HPV)危險(xiǎn)分型的關(guān)系。方法 宮頸病變患者120例，根據(jù)HPV危險(xiǎn)分型分為高危型組82例，低危型組38例；根據(jù)病理分型分為宮頸癌(CC組)47例、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ(CIN組)45例、慢性宮頸炎(CCS組)28例，檢測各組外周血Th17/Treg細(xì)胞及血清炎癥因子IL-17、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、IL-23水平，分析外周血Th17/Treg細(xì)胞與炎癥因子及宮頸病變程度和HPV感染危險(xiǎn)分型的相關(guān)性。結(jié)果 CC組與CIN組外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及Th17/Treg細(xì)胞，血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均較CCS組高，且CC組亦高于CIN組(P均<0.05)。高危型組外周血上述指標(biāo)均高于低危型組(P均<0.05)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg細(xì)胞與血清IL-17、TGF-β、IL-23水平及宮頸病變程度、HPV感染危險(xiǎn)分型均呈正相關(guān)(r分別為0.658、0.592、0.714、0.649、0.707，P均<0.05)。結(jié)論 外周血Th17/Treg細(xì)胞及炎癥因子水平升高與宮頸癌變、HPV感染高危型有關(guān)。

宮頸病變；輔助性T17細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；人乳頭瘤狀病毒

宮頸癌為臨床婦科常見惡性腫瘤，且呈年輕化趨勢發(fā)展，逐漸成為當(dāng)前社會關(guān)注重點(diǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約90%或以上宮頸癌患者合并伴有高危類型HPV感染[1，2]。因此，宮頸癌發(fā)病與HPV感染之間存在密切聯(lián)系，同時(shí)，伴隨宮頸HPV疫苗順利研制問世并得以臨床應(yīng)用，有關(guān)宮頸癌的免疫療法逐漸成為研究熱點(diǎn)。雖然關(guān)于HPV免疫逃逸主要機(jī)制尚未明確，但已有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)，輔助性T17(Th17)細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞均參與宮頸癌HPV免疫逃逸過程，且宮頸癌患者Th17及Treg細(xì)胞水平發(fā)生明顯變化[3]。有學(xué)者提出，Th17/Treg細(xì)胞和宮頸病變HPV感染之間存在一定相關(guān)性，對其進(jìn)行深入研究探討，有助于宮頸癌治療及預(yù)防工作順利進(jìn)行，并且有助于HPV感染臨床病情預(yù)測[4，5]。2014年3月～2016年12月，本文探討了外周血Th17/Treg細(xì)胞及炎癥因子與宮頸病變程度、HPV危險(xiǎn)分型的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宮頸病變患者120例。根據(jù)宮頸病變程度分為宮頸癌(CC組)47例，年齡35～61(46.82±1.33)歲；上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ～Ⅲ 45例(CIN組)，年齡36～63(46.77±1.53)歲；慢性宮頸炎(CCS)28例(CCS組)，年齡37～60(46.59±1.41)歲。經(jīng)HPV檢測分型顯示高危型82例(高危型組)、低危型38例(低危型組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)病理診斷結(jié)果證實(shí)有宮頸病變；均為初診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有糖尿病亦或是高血壓者；有心血管類疾病者；處于妊娠期的患者；有急慢性感染性疾病者；有轉(zhuǎn)移性腫瘤者。

1.2 宮頸HPV檢測 采用專用的宮頸刷在宮頸放置后，旋轉(zhuǎn)5～10圈后，將收集到的脫落細(xì)胞存于專用保存液內(nèi)，利用PCR技術(shù)實(shí)施HPV分型的檢測。

1.3 血清CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比的檢測 所有受試者采集其空腹靜脈血約3 mL，經(jīng)EDTA抗凝，在測定管內(nèi)分別添加抗凝血100 mL，而后加進(jìn)對應(yīng)抗體10 μL/管，經(jīng)避光、室溫下孵育約20 min。添進(jìn)Foxp3 熒光抗體約20 μL，在避光和4 ℃下靜置約30 min，添進(jìn)破膜劑約2 mL洗滌，予以1 200 r/min離心5 min。再棄去上清液，添加細(xì)胞染色液約2 mL，共洗滌2次，將重懸細(xì)胞染色液0.5 mL進(jìn)行混勻，利用流式細(xì)胞儀對樣本實(shí)施檢測。

1.4 血清CD4+IL17+Th17細(xì)胞百分比的檢測 將BPMI1650型培養(yǎng)基調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106/mL，而后接種在24孔培養(yǎng)板，之后添加佛波醇乙酯約25 ng/mL及離子霉素約1 μg/mL，以及莫能霉素約1.7 μg/mL。于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約5 h，調(diào)節(jié)細(xì)胞到1×107/mL。提取測定的試管和對照試管各一支，而后分別加進(jìn)細(xì)胞懸液100 μL及FitcCD4 10 μL，經(jīng)避光室溫下孵育約15 min，再行PBS洗滌1次，在兩管內(nèi)依次加進(jìn)細(xì)胞破膜劑200 μL，經(jīng)室溫避光孵育約15 min后，給予PBS洗滌1次，再重懸細(xì)胞，在檢測試管內(nèi)添加破膜劑200 μL及PE-IL17A 10 μL，在對照試管內(nèi)加進(jìn)破膜劑200 μL及對照抗體PE 10 μL，經(jīng)室溫避光下孵育約15 min，再行PBS洗滌1次，通過流式細(xì)胞儀對樣本實(shí)施檢測。

1.5 血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平的測定 取患者血清約3 mL，嚴(yán)格依據(jù)ELISA試劑盒說明書實(shí)施操作，依次測定血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平，通過酶標(biāo)儀在450 nm位置讀取光密度(OD)值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出濃度。

2 結(jié)果

2.1 不同類型宮頸病變患者外周血Th17、Treg細(xì)胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比較 見表1。

表1 各組外周血內(nèi)Th17、Treg細(xì)胞百分比及血清炎癥因子水平比較±s)

注：與CCS組相比，*P<0.05；與CIN組相比，△P<0.05。

2.2 不同HPV危險(xiǎn)分型患者外周血Th17、Treg細(xì)胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比較 見表2。

2.3 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg細(xì)胞與血清IL-17、TGF-β、IL-23水平、宮頸病變程度以及HPV危險(xiǎn)分型均呈正相關(guān)(r分別為0.658、0.592、0.714、0.649、0.707，P均<0.05)。

表2 不同HPV感染危險(xiǎn)分型患者外周血Th17、Treg細(xì)胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比較

注：與低危型組比較，*P<0.05。

3 討論

宮頸癌為女性高發(fā)癌癥，對全世界女性生命健康以及安全造成重大威脅，伴隨人們生活方式改變以及飲食習(xí)慣變化，我國宮頸癌發(fā)病率近年也不斷攀升，其治療及預(yù)防工作受到高度重視。根據(jù)流行病學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)婦女均有HPV感染史，并且高危型HPV持續(xù)感染為宮頸癌發(fā)病的重要誘因[6，7]。但是，當(dāng)HPV感染機(jī)體后，通常會遭到宿主免疫清除，剩余者保持長期感染狀態(tài)[8～10]。同時(shí)，僅少數(shù)高危類型HPV持續(xù)性感染者最終發(fā)展為宮頸癌。專家認(rèn)為，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的最重要原因在于宮頸HPV免疫逃逸。已知多種T淋巴細(xì)胞在惡性腫瘤微環(huán)境內(nèi)擔(dān)任重要角色，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞同屬T細(xì)胞亞群。其中Th17細(xì)胞能夠釋放出IL-17類型細(xì)胞因子，進(jìn)而起到促炎癥作用。Treg細(xì)胞則能夠發(fā)揮免疫抑制效果。宮頸癌患者Th17與Treg細(xì)胞水平失衡，提示Th17與Treg細(xì)胞有可能參與了宮頸HPV免疫逃避，但二者關(guān)系仍需深入探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，CC組與CIN組外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的百分比及Th17/Treg細(xì)胞以及血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均較CCS組高，且CC組亦高于CIN組，與張劍英等[11～13]研究結(jié)果一致。提示患者的宮頸病變程度與機(jī)體的免疫細(xì)胞及細(xì)胞炎癥因子緊密相關(guān)。Th17細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞亞群中一員，其為關(guān)鍵性介導(dǎo)炎癥類細(xì)胞，與多種自身免疫類疾病以及感染類疾病密切相關(guān)，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如IL-17。已知IL-17為重要的誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)以及趨化因子，其具有造成組織細(xì)胞發(fā)生炎性損傷的作用。Treg細(xì)胞屬于CD4類型細(xì)胞亞群，能夠分泌產(chǎn)生多種抑制性類型細(xì)胞因子，包括IL-10以及TGF-β等，且IL-10以及TGF-β均為免疫逃逸發(fā)生機(jī)制的重要因子。當(dāng)Treg細(xì)胞分泌出IL-10以及TGF-β后，以上細(xì)胞因子會共同發(fā)揮抑制作用，包括抑制效應(yīng)細(xì)胞自身功能，產(chǎn)生顆粒酶以及穿孔素等對效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行殺傷，并干擾效應(yīng)細(xì)胞自身正常代謝能力，以調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞方式對Treg細(xì)胞分化以及增殖等活動進(jìn)行干擾，進(jìn)而對機(jī)體免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制其功能的作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，高危型組外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及Th17/Treg細(xì)胞以及血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均較低危型組高，提示HPV感染的危險(xiǎn)程度也與機(jī)體的免疫細(xì)胞及細(xì)胞炎癥因子存在關(guān)聯(lián)，考慮與Th17與Treg細(xì)胞等的數(shù)目失調(diào)有關(guān)。

HPV感染引發(fā)宮頸病變主要分兩個(gè)階段，分別為宮頸HPV于患者機(jī)體內(nèi)免疫逃避，并造成持續(xù)性感染，然后造成宮頸發(fā)生器質(zhì)性病變[14，15]。目前已經(jīng)證實(shí)，高危型HPV發(fā)生持續(xù)性感染是引起宮頸病變重要原因，并且通常情況下，浸潤性宮頸癌與16以及18型HPV持續(xù)性感染密切相關(guān)[16]。同時(shí)，高危型HPV的E6及E7基因編碼類型蛋白質(zhì)為造成宮頸病變重要致病因素。通常Th17與Treg細(xì)胞二者之間存在一定平衡，如機(jī)體內(nèi)此平衡遭到打破，則容易發(fā)生癌變。高、低危型HPV感染患者外周血Th17/Treg細(xì)胞、IL-17以及TGF-β水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且本研究還發(fā)現(xiàn)，外周血Th17/Treg細(xì)胞與IL-17、TGF-β、IL-23、宮頸病變程度以及HPV感染的危險(xiǎn)分型均呈正相關(guān)。證實(shí)免疫細(xì)胞及炎癥因子與宮頸病變及HPV感染密切相關(guān)。

綜上所述，外周血內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞及炎癥因子與宮頸癌變、HPV危險(xiǎn)分型均有緊密聯(lián)系，臨床可考慮對此類指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，從而更好地輔助診治。

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山東省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(01-BS59)。

孫選(E-mail:sunxuan_1966@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.013

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B

1002-266X(2017)29-0041-03

2017-04-05)