RegⅣ基因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

胡啟立，李健，孟紅波,周波,王鋒，宋振順

(1安徽醫(yī)科大學(xué)上海臨床學(xué)院，上海200072；2上海市第十人民醫(yī)院)

·論著·

RegⅣ基因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

胡啟立1,2，李健2，孟紅波2,周波2,王鋒2，宋振順1,2

(1安徽醫(yī)科大學(xué)上海臨床學(xué)院，上海200072；2上海市第十人民醫(yī)院)

目的 探討RegⅣ基因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，于孵育箱中培養(yǎng)至70%～80%融合，分別以Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒載體(P-RegⅣ-shRNA組)以及Puro-shRNA慢病毒空載體(P-NC-shRNA組)感染細(xì)胞,并設(shè)立不感染組(PANC-1組)。48 h后，分別用qRT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)各組RegⅣ mRNA及蛋白的表達(dá)。通過(guò)CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，利用劃痕試驗(yàn)和Transwell小室侵襲試驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。將10只5周齡的雌性裸鼠隨機(jī)分成P-RegⅣ-shRNA裸鼠組和P-NC-shRNA裸鼠組，每組5只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P-RegⅣ-shRNA和P-NC-shRNA組細(xì)胞分別注射入上述兩組中。自接種日起每天觀(guān)察腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)情況，6周后處死裸鼠并取出瘤體稱(chēng)重并測(cè)量瘤體體積。結(jié)果 P-RegⅣ-shRNA組中RegⅣ mRNA和蛋白的表達(dá)水平較PANC-1組和P-NC-shRNA組均下降(P均<0.05)。P-RegⅣ-shRNA組細(xì)胞增殖活力較P-NC-shRNA組和PANC-1組下降(P均<0.05)。與PANC-1組、P-NC-shRNA組比較，P-RegⅣ-shRNA組48 h細(xì)胞遷移距離縮短，穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05)。PANC-1組、P-NC-shRNA組各觀(guān)察指標(biāo)比較，P均>0.05。與P-NC-shRNA裸鼠組比較，P-RegⅣ-shRNA裸鼠組腫瘤生長(zhǎng)速度慢，腫瘤體積小(P均<0.01)。結(jié)論 下調(diào)RegⅣ基因可抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲。

胰腺腫瘤；RegⅣ基因;再生基因家族；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

我國(guó)胰腺癌的發(fā)病率正處于不斷上升態(tài)勢(shì)[1]，早期轉(zhuǎn)移是其一個(gè)重要特性[2]，也是影響患者生存率的重要原因。再生基因家族(Reg家族)是一組分泌蛋白，在體內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡的作用[3]。RegⅣ是再生基因家族最近發(fā)現(xiàn)的成員，在包括胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種消化道惡性腫瘤中特異性表達(dá)[4]，過(guò)表達(dá)RegⅣ與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附和抗凋亡有關(guān)。近期研究表明，RegⅣ基因在胰腺癌的早期發(fā)生和進(jìn)展起著重要作用，提示RegⅣ基因可能是胰腺癌早期診斷和治療的靶基因[5, 6]。為觀(guān)察RegⅣ基因?qū)σ认侔㏄ANC-1細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，2015年9月～2016年12月，本試驗(yàn)通過(guò)慢病毒下調(diào)胰腺癌細(xì)胞PANC-1的RegⅣ基因表達(dá)[7]，探討其在胰腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、試劑及儀器 胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1由上海市第十人民醫(yī)院肝膽胰外科保存；5周齡體質(zhì)量約18 g雌性裸鼠購(gòu)自上海史萊克公司。Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒載體由上海漢恒生物有限公司構(gòu)建。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素(PS)、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Transwell小室(孔徑為8 μm)購(gòu)自美國(guó)Corning-Costar公司；人工細(xì)胞外基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染克隆的篩選 PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS、1% PS的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，將PANC-1細(xì)胞鋪入6孔板中每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，于孵育箱中培養(yǎng)至70%～80%融合，分別以Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒載體及Puro-shRNA慢病毒空載體感染細(xì)胞，分別命名為P-RegⅣ-shRNA、P-NC-shRNA組，并設(shè)立不感染組(PANC-1組)。感染6 h后換用無(wú)抗生素的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后，熒光顯微鏡下觀(guān)察，待80%以上細(xì)胞帶有綠色熒光后即可進(jìn)行篩選，將培養(yǎng)基換成含有嘌呤霉素(Puro，2 μg/mL)的選擇培養(yǎng)基，1周后進(jìn)行單克隆挑選，具體方法為：取100個(gè)細(xì)胞加入到10 mL完全培養(yǎng)基中沖懸，取96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，顯微鏡下觀(guān)察，挑出只有單個(gè)細(xì)胞的孔并作出標(biāo)記，2～3 d觀(guān)察1次，7 d換液，至細(xì)胞長(zhǎng)成集落后，采用胰酶消化，然后轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞長(zhǎng)到需要的數(shù)量，期間隔段時(shí)間向培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素篩選1次。

1.3 PANC-1細(xì)胞RegⅣ mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。利用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA。將提取得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR引物：RegⅣ上游引物：5′-CGCTGAGATGAACCCCAAG-3′，下游引物：5′-TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG-3′；β-actin上游引物：5′-CTGGAACGGTGAAGGTGCA-3′，下游引物：5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算 。

1.4 PANC-1細(xì)胞RegⅣ蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blotting法。使用蛋白裂解液裂解各組細(xì)胞獲得蛋白，并使用BCA法測(cè)定其蛋白濃度。使用蛋白上樣緩沖液及裂解液將各組蛋白樣品稀釋成等體積等濃度，每孔加入蛋白樣品20 μg，進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，使用PBST洗膜3次，每次10 min，后加二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，加ECL發(fā)光劑反應(yīng)2 min，X線(xiàn)光片上曝光1 min，膠片洗滌干燥，用FluorChemQ多功能成像和定量分析系統(tǒng)將膠片成像。結(jié)果重復(fù)3次得到穩(wěn)定結(jié)果。用 Image J 圖像軟件進(jìn)行灰度分析，以空白對(duì)照組灰度值為參考，對(duì)目的蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 PANC-1細(xì)胞增殖活力測(cè)定 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，稀釋成1×104/mL,接種于96孔板中，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，分別于24、48、72 h后換液，加入培養(yǎng)液100 μL，再每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育1 h后酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)光密度(A),并減去空白處A得到實(shí)際A值，每組做3個(gè)復(fù)孔取平均值。增殖活力=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照A值)/(初始A值-空白對(duì)照A值)。

1.6 PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。在6孔板中分別加入各組細(xì)胞，每孔鋪入5×105個(gè)細(xì)胞，每孔加完全培養(yǎng)液2 mL,并放入5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合后，使用無(wú)菌的200 μL移液器tip頭在培養(yǎng)板底部呈“+”劃痕，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，去除劃下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)并加入不含血清的純DMEM培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下拍照，記錄初始間距，置入孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后再次在相同的位置拍照，每組取5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，取平均值作為遷移的相對(duì)間距，并與初始間距進(jìn)行比較。

1.7 PANC-1細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。將各組細(xì)胞分別鋪到6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化后用不含血清的純DMEM培養(yǎng)基沖懸至1×105/mL。用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37 ℃環(huán)境下30 min使Matrigel聚合成凝膠，小室使用前用純培養(yǎng)基水化1 h。將上述準(zhǔn)備的細(xì)胞懸液加到Transwell小室的上室，每孔加細(xì)胞懸液200 μL，注意使細(xì)胞均勻分布在上室內(nèi)，下室內(nèi)加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基800 μL，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h后取出，用棉簽頭去除Matrigel基質(zhì)膠和未穿過(guò)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色3 min，用刀片將膜切下，貼到載玻片上，顯微鏡下進(jìn)行拍照并觀(guān)察，隨機(jī)取5個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算平均值。

1.8 裸鼠成瘤試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P-RegⅣ-shRNA和P-NC-shRNA組細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化離心稀釋到細(xì)胞密度為1×107/mL。將10只5周齡的雌性裸鼠隨機(jī)分成P-RegⅣ-shRNA裸鼠組和P-NC-shRNA裸鼠組，每組5只，1%戊巴比妥鈉0.1 mL腹腔注射麻醉。每組分別接種1種細(xì)胞，每只裸鼠下注射細(xì)胞懸液0.1 mL。接種細(xì)胞后放置于恒溫( 26±2)℃、濕度 45%～50%、無(wú)菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，自接種日起每天觀(guān)察腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)情況，6周后處死裸鼠并取出瘤體稱(chēng)重,測(cè)量瘤體體積。腫瘤體積按V=長(zhǎng)×寬2×0.5公式計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 各組RegⅣ mRNA及蛋白表達(dá)比較 PANC-1組、P-NC-shRNA組、P-RegⅣ-shRNA組中RegⅣ mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.07、1.06±0.07、0.22±0.03；RegⅣ蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為2.57±0.10、2.53±0.12、0.50±0.06。P-RegⅣ-shRNA組中RegⅣ mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量較PANC-1組和P-NC-shRNA組均下降(P均<0.05)。前兩組間比較，P均>0.05。

2.2 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活力比較 PANC-1組24、48、72 h后細(xì)胞增殖活力分別為0.60±0.07、1.25±0.06、2.63±0.09，P-NC-shRNA組分別為0.58±0.07、1.17±0.04、2.43±0.05，P-RegⅣ-shRNA組分別為0.41±0.05、0.75±0.06、1.49±0.05。P-RegⅣ-shRNA組細(xì)胞增殖活力較P-NC-shRNA組和PANC-1組下降(P均<0.05)。前兩組間比較，P均>0.05。

2.3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力比較 PANC-1組、P-NC-shRNA組、P-RegⅣ-shRNA組 48 h 遷移距離分別為(0.37±0.14)、(0.31±0.18)、( 0.03±0.02)mm,穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(32.2±1.7)、(28.0±3.5)、(18.7±5.1)個(gè)/HP。與PANC-1組、P-NC-shRNA組比較，P-RegⅣ-shRNA組各指標(biāo)均降低(P均<0.05)。前兩組間比較，P均>0.05。

2.4 RegⅣ對(duì)裸鼠體內(nèi)胰腺癌PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 裸鼠皮下接種1×106個(gè)細(xì)胞后100%可以長(zhǎng)出腫瘤，P-NC-shRNA裸鼠組、P-RegⅣ-shRNA裸鼠組接種細(xì)胞后長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)腫瘤的時(shí)間分別為(5.2±0.8)d、(8.6±0.9)d，中間無(wú)一例死亡。P-RegⅣ-shRNA裸鼠組和P-NC-shRNA裸鼠組的腫瘤體積分別為(1.304±0.148)、(2.645±0.583)cm3。P-RegⅣ-shRNA裸鼠組腫瘤生長(zhǎng)速度慢于P-NC-shRNA組，腫瘤體積小于P-NC-shRNA組(P均<0.01)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果[8]，胰腺癌的早期轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌患者預(yù)后的重要原因。90%胰腺癌患者確診時(shí)已處于疾病的中晚期[9]，因此針對(duì)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對(duì)于提高胰腺癌診斷價(jià)值和治療效果非常重要。

RegⅣ基因在消化道惡性腫瘤中的發(fā)病及發(fā)展中，特別是在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡中發(fā)揮重要作用。研究表明，其在包括胰腺癌的多種腫瘤組織中表達(dá)增加[3, 4, 10]。Hedgehog信號(hào)通路是生物體內(nèi)的一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路。Hedgehog信號(hào)通路在包括胰腺癌的多種腫瘤中異常激活，在胰腺癌細(xì)胞株和組織中Hedgehog信號(hào)通路均被異常激活[11～14]。GLI1是Hedgehog信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，RegⅣ是GLI1的下游靶基因[15]。本試驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)及體外試驗(yàn)來(lái)探討RegⅣ基因?qū)σ认偌?xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。本研究中，我們通過(guò)將帶有shRNA-RegⅣ干擾序列的慢病毒轉(zhuǎn)染到胰腺癌細(xì)胞PANC-1中，從mRNA和蛋白水平證實(shí)RegⅣ表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)提示，下調(diào)RegⅣ基因的細(xì)胞生長(zhǎng)速度較轉(zhuǎn)染空病毒的細(xì)胞明顯減慢。進(jìn)而我們進(jìn)行了裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)，在給裸鼠皮下分別接種P-RegⅣ-shRNA細(xì)胞和P-NC-shRNA細(xì)胞相同的時(shí)間后，P-RegⅣ-shRNA裸鼠組的腫瘤體積較P-NC-shRNA裸鼠組減小。體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明，下調(diào)RegⅣ基因可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。

我們還通過(guò)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell侵襲試驗(yàn)來(lái)探討下調(diào)RegⅣ基因后PANC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力變化。在劃痕試驗(yàn)及Transwell侵襲試驗(yàn)中，我們利用不含血清的純DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞缺乏增殖所需的必需生長(zhǎng)因子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增殖受到抑制，消除增殖對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，下調(diào)RegⅣ基因后PANC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力均較P-NC-shRNA組下降，表明RegⅣ基因可以加強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，該結(jié)果與RegⅣ基因在其他癌癥中的研究[4, 10, 16]結(jié)果一致。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，RegⅣ通過(guò)GPR37促進(jìn)胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移。Bishnupuri等[17]研究發(fā)現(xiàn)，RegⅣ基因在結(jié)直腸癌中可以促進(jìn)有絲分裂。Zhu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中RegⅣ與MMP-7相互作用共同影響患者預(yù)后。但RegⅣ基因在胰腺癌中如何發(fā)揮作用的機(jī)制還不清楚，具體研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。

綜上所述，本研究結(jié)果表明RegⅣ基因在胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用，其有可能是胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

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Effects of RegIV on proliferation, invasion, and migration of pancreatic cancer cells PANC-1

HUQil1,LIJian,MENGHongbo,ZHOUBo,WANGFeng,SONGZhenshun

(1ShanghaiClinicalFacultyofAnhuiMedicalUniversity,Shanghai200072,China)

Objective To explore the effects of RegIV gene on the proliferation, invasion, and migration of pancreatic cancer cells PANC-1. Methods PANC-1 cells in logarithmic growth phase were cultured in the incubator until they reached 70%-80% confluence. PANC-1 cells were transfected with Puro-P-RegIV-shRNA lentiviral vector (P-RegⅣ-shRNA group) and Puro-shRNA lentiviral empty vector (P-NC-shRNA group), respectively. Cells without transfection or with null-transfection were served as controls (PANC-1 group). At 48 h after transfection, quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting were used to detect the expression of RegIV mRNA and protein. The CCK-8 test was used to detect the proliferation. Scratch test and Transwell chamber test were used to detect the migration and invasion of the cells, respectively. Ten 5-week-old female nude mice were randomly divided into the P-RegⅣ-shRNA nude mouse group and P-NC-shRNA nude mouse group with 5 in each group, which were then injected with P-RegⅣ-shRNA and P-NC-shRNA cells in logarithmic growth phase in the above two groups. The growth of tumor nodules was observed every day from the day of inoculation. After 6 weeks, the nude mice were sacrificed and the tumor volume was measured. Results The expression levels of RegIV mRNA and protein in the P-RegⅣ-shRNA group were significantly lower than those of the PANC-1 group and P-NC-shRNA group (bothP<0.05). Cells in the P-RegⅣ-shRNA group had a lower proliferative capacity than cells in the P-NC-shRNA group and PANC-1 group (P<0.05). Moreover, compared with the PANC-1 group and P-NC-shRNA group, Puro-P-RegIV-shRNA group showed shorter transmembrane distance and decreased number of transmembrane cells, indicating decreased migration ability (allP<0.05). No significant differences were found in the above parameters between the PANC-1 group and P-NC-shRNA group (allP>0.05). Besides, tumor growth rate and the tumor volume in nude mice were decreased significantly in the P-RegⅣ-shRNA nude mouse group as compared with those of the P-NC-shRNA nude mouse group (P<0.01).Conclusion Down-regulation of RegIV could inhibit the proliferation, invasion, and migration of PANC-1 cells.

pancreatic neoplasms; RegIV gene; regenerating gene family; cell proliferation; cell invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81670582)。

胡啟立(1991-)，男，在讀碩士，主要研究方向?yàn)橐认侔┑幕A(chǔ)研究。E-mail:1061167453@qq.com

宋振順(1961-)，男，教授，主要研究方向?yàn)楦杉?xì)胞移植。E-mail:zhenshunsong@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.001

R737.9

A

1002-266X(2017)29-0001-04

2017-04-07)