不同調(diào)控因子下GUS基因在馬鈴薯塊莖中瞬時表達的影響

舒 銳,姚甜甜,李 燕,臧傳江,焦 健,蘭成云,劉少軍*

1.山東省輕工農(nóng)副原料研究所,山東 高密 261500

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018

不同調(diào)控因子下GUS基因在馬鈴薯塊莖中瞬時表達的影響

舒 銳1,2,姚甜甜1,李 燕1,臧傳江1,焦 健1,蘭成云1,劉少軍1*

1.山東省輕工農(nóng)副原料研究所,山東 高密 261500

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018

本文以馬鈴薯塊莖為研究材料，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法，通過組織化學(xué)染色法檢測GUS基因的瞬時表達，并研究了乙酰丁香酮濃度、真空強度、浸染時間和共培養(yǎng)時間對GUS基因瞬時表達的影響。結(jié)果表明不同真空強度和共培養(yǎng)時間對GUS基因瞬時表達水平的影響差異極顯著，且當(dāng)真空強度為1 kPa、共培養(yǎng)時間為2 d時表達水平較高。

馬鈴薯;GUS;調(diào)控因子;瞬時表達

利用根癌農(nóng)桿菌感染植物受傷組織，然后將質(zhì)粒上的外源基因?qū)氩⒄系街参锛毎娜旧w上，在經(jīng)過誘導(dǎo)分化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株，這是目前馬鈴薯塊莖最常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，但是通常具有遺傳轉(zhuǎn)化和再生效率低、外源基因表達不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化周期長和費用昂貴等問題。隨著植物功能基因組學(xué)的發(fā)展，對外源基因在植物細胞內(nèi)表達功能分析的快速性和高效性要求越來越高。1993年Rossi等創(chuàng)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法，通過真空抽濾將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌滲透到植物細胞，然后根據(jù)目的基因瞬時表達來檢測農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA的轉(zhuǎn)化效率[1]。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比較，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法中繁瑣的組織培養(yǎng)過程，大大縮減了試驗時間，方法更加簡單快速，而且還具有表達效率高、安全性好等優(yōu)點[2]。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法已經(jīng)在煙草、擬南芥、萵苣、番茄、草莓、梨等多種植物中得到應(yīng)用。李靜等以萵苣作為研究材料，以GUS基因作為報告基因，利用農(nóng)桿菌滲透法，采用正交實驗設(shè)計，分析了培養(yǎng)的菌液濃度、誘導(dǎo)物乙酰丁香酮的濃度、真空抽濾時間和共培養(yǎng)時間等影響因子對萵苣的瞬時表達水平的影響，建立了較高表達水平的瞬時轉(zhuǎn)化體系[3]。

GUS基因是目前應(yīng)用最廣泛的一種報告基因，GUS能與底物4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，4-MUG)反應(yīng)產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)，通過熒光分析可以進行GUS活性的定量檢測，GUS作為報告基因來檢測外源基因的轉(zhuǎn)化效率方法簡單，靈敏度高[4]。本研究以馬鈴薯塊莖為研究材料，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法[5]，分析了不同的影響因子：乙酰丁香酮濃度、真空強度、浸染時間和共培養(yǎng)時間對馬鈴薯塊莖GUS基因瞬時表達水平的影響，以用來研究影響馬鈴薯塊莖中GUS報告基因瞬時表達的關(guān)鍵因素和最佳條件，對于將來建立馬鈴薯塊莖高效瞬時表達體系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料和菌株

本研究采用鄂馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）3號品種（E3）的塊莖作為轉(zhuǎn)化受體材料。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為LBA4404，中間載體為pBI-121。

1.2 農(nóng)桿菌的制備

取10mL低溫保存的菌液，接種于10 mL液體YEB（內(nèi)含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan）培養(yǎng)基中，28℃，250 r/m培養(yǎng)20～24 h，再取1 mL菌液接入40 mL液體YEB培養(yǎng)基，28℃，250 r/min培養(yǎng)大約6 h。

將40 mL菌液在4℃5000 r/min離心10 min，去上清得到菌體。加入40 mL MS液體培養(yǎng)基重新懸浮，將菌液OD600值調(diào)整至約0.8，室溫（22℃）靜置1 h后備用。

1.3 影響因子的設(shè)置

以LBA4404[pBI-121]浸染馬鈴薯E3塊莖，按照如下設(shè)置的處理進行實驗。

將馬鈴薯E3塊莖縱切成1～3 mm薄片，用蒸餾水洗凈，在含不同誘導(dǎo)物乙酰丁香酮濃度（0、200、400 μmol/L）的菌懸液中以不同真空強度（1、10、101 kPa）浸染抽濾（10、20、30 min），然后將薯片用無菌水沖洗1次，放在用無菌水浸濕的濾紙的培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)（2、4、6 d）。培養(yǎng)后取薯片進行GUS組織化學(xué)染色，GUS定量檢測。

設(shè)置4個影響因子（乙酰丁香酮濃度、真空強度、浸染時間、共培養(yǎng)時間），3個不同水平試驗（表1），采用L9（34）正交表進行正交設(shè)計，試驗重復(fù)3次。最后分析GUS定量檢測結(jié)果。

1.4 GUS基因瞬時表達的檢測

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的實驗材料培養(yǎng)完成后進行GUS組織化學(xué)染色[6]，將薯片放入燒杯中，加入GUS 染色液（20 mmol/L X-Gluc，0.2 mmol/L Na2HPO4，0.2 mmol/L NaH2PO4，0.1%Triton X-100，10 mmol/L K3Fe(CN)6，180 mmol/L EDTA）將薯片浸泡，37℃染色9 h后倒掉染色液，加入75%（V/V）工業(yè)酒精進行脫色。熒光分析法測定GUS活性并記錄實驗數(shù)據(jù)。

試驗所得數(shù)據(jù)用SAS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，并對平均數(shù)用新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同影響因子處理的GUS表達情況

對4個影響因子設(shè)置的9種處理均獲得了瞬時表達的馬鈴薯塊莖，但不同處理組合的GUS活性不同，如表1所示。

表1 不同影響因子處理的GUS表達情況Table 1 Expression level of GUS activity

2.2 不同影響因子對瞬時表達水平的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達試驗中，不同處理組合對GUS基因瞬時表達水平產(chǎn)生了影響。通過對不同處理組合的GUS活性數(shù)據(jù)進行方差分析（見表2），可以看出，真空強度和共培養(yǎng)時間二因素對GUS基因瞬時表達水平的影響差異極顯著，而乙酰丁香酮濃度和浸染時間則對GUS基因瞬時表達水平影響差異不顯著。

表2 GUS活性各組合間的方差分析Table 2 Variance analysis on GUS activity among combinations

進一步對真空強度和共培養(yǎng)時間各自的三個水平進行多重比較（見表3），可以看出，不同真空強度水平對GUS基因瞬時表達的影響差異極顯著，其中真空強度為1 kPa時GUS活性最大，該真空強度與101 kPa之間的差異達到0.01顯著水平，與10 kPa處理間無顯著差異，10 kPa與101 kPa處理間差異顯著。由表3還可以看出，不同共培養(yǎng)時間水平對GUS基因瞬時表達的影響差異極顯著，共培養(yǎng)時間為2 d時GUS基因瞬時表達水平最大，其中，共培養(yǎng)時間為2 d時與共培養(yǎng)時間4 d、6 d之間的差異均達到0.01顯著水平，而共培養(yǎng)時間4 d和6 d處理間差異不顯著。

由上述分析可知當(dāng)真空強度為1 kPa、共培養(yǎng)時間為2 d時GUS基因瞬時表達水平到達最優(yōu)。

表3 真空強度、共培養(yǎng)時間對GUS活性影響的多重比較Table 3 Multiple comparisons of the effects of vacuum intensity and co culture time on GUS activity

3 討論

共培養(yǎng)時間是影響馬鈴薯塊莖瞬時表達水平的重要因素，因為農(nóng)桿菌的附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在共培養(yǎng)階段完成。有研究表明共培養(yǎng)時間過長，則會因為農(nóng)桿菌的過度生長導(dǎo)致植物細胞受毒害而死亡[7]。本試驗過程中也發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)時間為4 d時有的馬鈴薯塊莖出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，共培養(yǎng)培養(yǎng)時間越長，腐爛現(xiàn)象越嚴(yán)重，因此培養(yǎng)時間越長反而不利于GUS基因的表達。適當(dāng)?shù)恼婵諠B透處理可以增加農(nóng)桿菌對植物細胞的附著，有利于基因的表達，但真空強度過大會對植物和農(nóng)桿菌細胞造成傷害，從而降低瞬間表達效率[8]，本試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)真空強度為1 kPa時馬鈴薯塊莖的GUS基因瞬時表達水平最大，真空強度越大，表達水平越低。本試驗中乙酰丁香酮濃度對GUS基因瞬時表達水平影響差異不顯著，可能與馬鈴薯塊莖切片自身就能分泌復(fù)合酚類化合物有關(guān)，這些酚類物質(zhì)已經(jīng)起到了活化vir基因的作用[9]，所以加入乙酰丁香酮并不能明顯提高馬鈴薯塊莖GUS基因的表達。試驗中農(nóng)桿菌并沒有隨著浸染時間的增加而更多的侵入馬鈴薯塊莖，這可能與馬鈴薯塊莖致密的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，致密的組織結(jié)構(gòu)可以起到阻止農(nóng)桿菌侵入的作用，因此可能僅切片表面獲得GUS基因表達，增加浸染時間對GUS基因表達并無太大影響。

由于試驗中采用了含有GUS基因的中間載體pBI-121，其可能在農(nóng)桿菌中表達，因此進行試驗分析排除其可能造成的干擾，結(jié)果表明GUS基因在農(nóng)桿菌中的表達未對本試驗結(jié)果造成影響，在此予以說明。

4 結(jié)論

本研究通過設(shè)置不同調(diào)控因子來研究GUS基因在馬鈴薯塊莖中的瞬時表達情況，試驗發(fā)現(xiàn)真空強度和共培養(yǎng)時間是影響馬鈴薯塊莖GUS基因瞬時表達水平的關(guān)鍵因素，并且當(dāng)真空強度為1 kPa、共培養(yǎng)時間為2 d時GUS基因瞬時表達水平最大，乙酰丁香酮濃度和浸染時間不是影響馬鈴薯塊莖GUS基因瞬時表達水平的關(guān)鍵因素。

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TheEffectsofDifferentRegulatoryFactorsonTransientExpressionof GUSGeneinPotatoTubers

SHURui1,2,YAOTian-tian1,LIYan1,ZANGChuan-jiang1,JIAOJian1,LAN Cheng-yun1,LIUShao-jun1*
1.Shandong Light Industry Institute of Agricultural and Sideline Raw Materials,Gaomi261500,China
2.College of Horticulture Science and Engineering/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China

The GUS gene was transiently expressed in potato tubers by agrobacterium-mediated transformation and the expression the GUS was detected by histochemical staining.The effects of acetyligenone concentration,vacuum intensity,immersion time,and total culture time on the expression of GUS gene was investigated.The results show that the different vacuum strength and co-culture time exhibit the notable influence on GUS expression and the expression levels are higher when the vacuum intensity is 1kPa and the co-culture time is 2 days.

Potato;GUS;regulatory factors;transient expression

S532

A

1000-2324(2017)04-0545-04

2015-07-14

2015-12-07

舒 銳(1987-),男,碩士研究生,主要從事園藝植物栽培育種研究.E-mail:shrhero@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:wly459@sohu.com