鐵皮石斛組培體系的建立

鄭子首,孫晨瑜,呂曉倩,侯文秋,李 濱

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 泰安 271018

鐵皮石斛組培體系的建立

鄭子首,孫晨瑜,呂曉倩,侯文秋,李 濱*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 泰安 271018

鐵皮石斛作為一種重要的抗癌抑癌藥物，在全民養(yǎng)生的今天越來(lái)越多的成為了人們消費(fèi)的熱點(diǎn)。然而，由于野生的鐵皮石斛非常稀少而且非常昂貴，不適合大眾消費(fèi)。所以建立一套適合工業(yè)化生產(chǎn)的組培體系成為了發(fā)展的趨勢(shì)。以幼嫩的鐵皮石斛帶節(jié)莖段為原材料，1/2MS作為培養(yǎng)基，探究了不同激素濃度及其他因素對(duì)鐵皮石斛快繁和組培的影響。再以組培出的幼苗為原材料，研究了溫度、水質(zhì)、培養(yǎng)基質(zhì)及澆水方式等對(duì)鐵皮石斛煉苗的影響。結(jié)果表明，鐵皮石斛快繁的最佳激素濃度為6-BA,1.0 mg/L和NAA，1.0 mg/L，及1%的活性炭，誘導(dǎo)率為12.5%；組培的最佳激素濃度為6-BA,1.5 mg/L及NAA,2.0 mg/L或6-BA,0.5 mg/L,NAA,0.5 mg/L和2,4-D,1.5 mg/L，誘導(dǎo)率都在80%以上。鐵皮石斛的最優(yōu)煉苗條件為25℃，光照過(guò)的自來(lái)水澆灌；最適合的培養(yǎng)基質(zhì)為水苔+直徑約為0.5～1.0 cm的樹(shù)皮。

鐵皮石斛;組培

鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)是一種名貴的中藥材，在民間，被譽(yù)為“救命仙草”，具有抗癌、防癌、抗輻射、抗衰老，提高人體免疫力、擴(kuò)張血管、抗血小板凝結(jié)等多種功能。但鐵皮石斛自然結(jié)實(shí)率很低，僅為0.31%。目前全國(guó)野生的鐵皮石斛越來(lái)越少，已不足500 kg，全國(guó)市場(chǎng)上每年流通的正宗野生鐵皮楓斗不到數(shù)十公斤，而早在87年就被國(guó)家列為野生藥材重點(diǎn)二級(jí)保護(hù)瀕危植物。

今年來(lái)，鐵皮石斛在組培快繁方面取得了部分的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外的研究?jī)?nèi)容涉及了培養(yǎng)基選擇[1-3]、外植體選擇[4-7]、激素配比[5-6,8-10]等諸多方面。然而，對(duì)于天然添加物的種類、濃度、添加時(shí)機(jī)等方面的結(jié)論差異較大。李筑等[2]對(duì)石斛煉苗的基質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，但還有水源等幾個(gè)方面沒(méi)有考慮到，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組培原料 選用純種的生長(zhǎng)狀況均一的鐵皮石斛為快繁和組培的原料。

1.1.2 煉苗原料 組培獲得的生長(zhǎng)狀況相同的幼苗?；|(zhì)：Ⅰ直徑大約為0.5～1 cm的樹(shù)皮。Ⅱ直徑大約為0.5～1 cm樹(shù)皮+直徑大約為1 cm的磚頭。Ⅲ水苔+直徑大約為0.5～1 cm的樹(shù)皮。Ⅳ腐殖土。Ⅴ腐殖土和少量珍珠巖配成的混合基質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 快繁 Ⅰ外植體消毒:選取生長(zhǎng)旺盛無(wú)病害的粗壯植株莖段，每一節(jié)為一段，剝?nèi)デo表皮，用去離子水洗凈，放入超凈工作臺(tái)中。用75%酒精消毒30 s，用5%的NaClO消毒8 min，最后用去離子水洗凈，切去邊緣。Ⅱ外植體的培養(yǎng):將處理過(guò)的莖段接入1/2的MS+3%的蔗糖+0.1%的活性炭的培養(yǎng)基中，用不同激素進(jìn)行處理。然后將其放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70 d左右。

1.2.2 組培 Ⅰ外植體消毒：方法同上。Ⅱ愈傷組織的形成：將橫切過(guò)的鐵皮石斛帶節(jié)莖段放入不同激素的1/2MS+3%蔗糖的固體培養(yǎng)基中并用不同激素進(jìn)行處理。Ⅲ當(dāng)誘導(dǎo)分化出的不定芽長(zhǎng)到大約3 cm時(shí)，將不定芽沿根部的愈傷組織切下，并轉(zhuǎn)移到最佳生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其分化成不定根。本文著重研究不同激素處理對(duì)鐵皮石斛脫分化形成不定芽的影響。

1.2.3 煉苗 Ⅰ原材料的選取:從組培苗中選取生長(zhǎng)狀況相近，莖稈健壯，高度相差較小的鐵皮石斛組培苗若干，洗凈根部的培養(yǎng)基，并消毒備用。Ⅱ培養(yǎng)基質(zhì)的配置:購(gòu)買實(shí)驗(yàn)所需的各種土壤基質(zhì)，配制成以下幾種培養(yǎng)基質(zhì)：①直徑約為0.5～1 cm的樹(shù)皮。②直徑約為0.5～1 cm樹(shù)皮+直徑約為1 cm的磚頭。③水苔+直徑約為0.5～1 cm的樹(shù)皮。④腐殖土。⑤腐殖土+少量珍珠巖配成的混合基質(zhì)。（以下稱①、②、③、④、⑤）Ⅲ分組對(duì)照：按照溫度、培養(yǎng)基質(zhì)、水源的不同將選取的鐵皮石斛組培苗平均分成大小株數(shù)相近的30組，并設(shè)置一組重復(fù)組作為對(duì)照，培養(yǎng)觀察，并進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理對(duì)鐵皮石斛的快繁的影響

野生石斛體內(nèi)存在大量的內(nèi)生共生菌，普通滅菌方法難以根除，加入活性炭后能夠顯著降低鐵皮石斛的染菌率。用不同濃度的激素（表1）進(jìn)行處理后得出外植體在培養(yǎng)30 d左右就可以明顯發(fā)現(xiàn)石斛腋芽的出現(xiàn)，60 d石斛幼苗幾乎發(fā)育完全，可以進(jìn)行煉苗。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，鐵皮石斛莖段在（1）條件下誘導(dǎo)率最高，為12.5%，(2)、(3)分別為11.2%和5.0%。結(jié)果表明，鐵皮石斛快繁最佳培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L的6-BA，3%的蔗糖+0.1%的活性炭，并對(duì)外植體進(jìn)行切割處理。（圖1）

表1 鐵皮石斛快繁不同激素處理Table 1 Different phytohormone in micropropagation rapid propagation ofDendrobium officinaleKimura et Migo

圖1 鐵皮石斛快繁Fig.1The result of micro-propagation rapid propagation ofDendrobium officinaleKimura et Migo

2.2 不同激素處理對(duì)鐵皮石斛的組培的影響

用不同濃度的激素（表2）對(duì)鐵皮石斛大量進(jìn)行處理，最終獲得了幾組誘導(dǎo)率很高的濃度配比。其中，誘導(dǎo)率最高的是1.5 mg/L的6-BA和2.0 mg/L的NAA，其誘導(dǎo)率為96%，其次是0.5 mg/L的6-BA，0.5 mg/L的NAA和1.5 mg/L的2，4-D，其誘導(dǎo)率是大約83%。其他濃度誘導(dǎo)率都在50%以下。因?yàn)榧尤牖钚蕴烤哂辛己玫囊志Ч?，因此在組培過(guò)程中依舊保存著0.1%的活性炭。（愈傷組織見(jiàn)圖2）

表2 鐵皮石斛組培不同激素處理Table 2 Different phytohormone in tissue culture ofDendrobium officinaleKimura et Migo

圖2 鐵皮石斛愈傷組織Fig.2 The callus ofDendrobium officinaleKimura et Migo

2.3 鐵皮石斛的煉苗

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一次性澆透水過(guò)后，3天之后基質(zhì)干透，需再次澆水，為防止水分過(guò)多爛根，水分較少根部枯萎，澆水周期定為3天。每隔十天觀察記錄一次現(xiàn)象，大約3個(gè)月之后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)出組培苗的成活率和幼苗的生長(zhǎng)速率，可得出最適宜石斛煉苗的條件和對(duì)其影響最大的外界因素，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行的生產(chǎn)培育工作。通過(guò)對(duì)鐵皮石斛的溫度、培養(yǎng)基質(zhì)、水源等影響因素進(jìn)行分組處理（表3、4），經(jīng)一年的觀察，以及對(duì)出芽時(shí)間和數(shù)量的記錄，得出了鐵皮石斛煉苗最快恢復(fù)（以分化出第一芽的時(shí)間為依據(jù)）的培養(yǎng)條件為30℃，⑤號(hào)培養(yǎng)基質(zhì)并用光照過(guò)的自來(lái)水澆灌，第一芽分化的時(shí)間只有10 d。但這種條件對(duì)于鐵皮石斛日后生長(zhǎng)不利，極易會(huì)出現(xiàn)枯死、爛根等情況。后期有利于鐵皮石斛生長(zhǎng)（以植株長(zhǎng)勢(shì)及最后出芽總數(shù)為依據(jù)）的培養(yǎng)條件是25℃，③號(hào)培養(yǎng)基質(zhì)。水質(zhì)方面，自來(lái)水與光照過(guò)的自來(lái)水效果差不多，但均優(yōu)于去離子水。在此條件下幼苗全部存活并且長(zhǎng)勢(shì)良好，澆水次數(shù)方便人工管理，適合大面積煉苗（圖3）。

表3 30℃時(shí)的實(shí)驗(yàn)處理Table 3 The number cultivated in 30℃

表4 25℃時(shí)的實(shí)驗(yàn)處理Table 4 The number cultivated in 25℃

圖3 鐵皮石斛煉苗情況Fig.3 The conditions of hardening-seedlings ofDendrobium officinaleKimura et Migo

3 討論

鐵皮石斛屬于藥用價(jià)值極高的產(chǎn)品。在快速生長(zhǎng)的過(guò)程中，會(huì)造成藥用成分質(zhì)量的下降。下一步的研究方向應(yīng)該是改良培養(yǎng)基的配方以及培養(yǎng)環(huán)境來(lái)降低或防止此現(xiàn)象。如果要實(shí)現(xiàn)大批量的生產(chǎn)，培養(yǎng)基的成本也是亟待解決的方面，優(yōu)化培養(yǎng)基的配方，使其物美價(jià)廉。

另外在煉苗過(guò)程中，建議先使用135的條件進(jìn)行培養(yǎng)，出芽后立即轉(zhuǎn)移到233的條件中。

[1]宋 順,許 奕,王必尊,等.不同培養(yǎng)基成分對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(13):133-139

[2]李 筑.鐵皮石斛煉苗基質(zhì)的篩選研究[J].中國(guó)民間醫(yī)藥,2015,2(2):27-28

[3]崔現(xiàn)亮.鐵皮石斛生根壯苗培養(yǎng)基及煉苗技術(shù)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2015,1(1):104-108

[4]陳 希,黃丹丹.鐵皮石斛的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2011,23(8):19-22

[5]溫明霞,聶振朋,林 媚,等.鐵皮石斛組織培養(yǎng)與快速繁殖研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,28(3):227-230

[6]宋 順,許 奕,李敬陽(yáng),等.鐵皮石斛的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(33):286-290

[7]遠(yuǎn)凌威.三個(gè)產(chǎn)地鐵皮石斛組織培養(yǎng)及其抗寒生理研究[D].信陽(yáng):信陽(yáng)師范學(xué)院,201

[8]王 聰.鐵皮石斛快速繁殖技術(shù)研究[D].廣州:仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,2014

[9]翟明恬,劉紅霞,王亞妮.鐵皮石斛組織快繁及移栽培養(yǎng)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,43(1):50-53,71

[10]黃 勇.鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].文山學(xué)院學(xué)報(bào),2013,26(6):14-19

TissueCultureSystemEstablishmentofDendrobiumofficinaleKimuraetMigo

ZHENG Zi-shou,SUN Chen-yu,LV Xiao-qian,HOU Wen-qiu,LI Bin*
College of Life Sciences/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China

As an important medicine for anticancer,Dendrobium officinaleKimura et Migo becomes a hot topic during the health-preserving society.WildDendrobium officinaleis very rare and very expensive and not suitable for public consumption.So the establishment of the tissue culture system suitable for industrial production has become the tendency.We used its stalk as material and 1/2 MS as basal culture medium,investigated the effects of different hormone concentration and other factors on the tissue culture ofD.Officinale,and then used these plants cultivated as material to explore the effects of temperature,water quality,culture medium and watering method on the seedling ofDendrobium officinale.The results showed that the best medium of rapid multiplication was basal culture medium+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA+1%PAC,and it’s inductivity was 12.5%.The best medium of tissue culture was basal culture medium+1.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA or 0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA or 0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 2,4-D,and their inductivities were all over 80%.The best conditions to hardening-seedlings was 25℃+lighted tap wate,the most suitable culture medium was sphagna+0.5～1.0 cm barks in diameter.

Dendrobium officinaleKimura et Migo;tissue culture

S567.239;Q813.1

A

1000-2324(2017)04-0537-03

2016-04-12

2016-04-10

鄭子首(1996-),男,本科生.E-mail:775618761@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:agribiolab@163.com