周 鵬林 瑋周祥斌陳曉陽(yáng)
(1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院,廣東 廣州510520;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510642)
刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR體系建立與優(yōu)化*
周 鵬1,2林 瑋2周祥斌2陳曉陽(yáng)2
(1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院,廣東 廣州510520;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510642)
以刨花潤(rùn)楠(Machilus pauhoi)1.5 a生小苗幼嫩葉片為試材,對(duì)影響刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR擴(kuò)增的模板DNA量、引物、dNTP和Mg2+體積摩爾濃度、Taq DNA聚合酶、退火溫度6個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系為:25 μL的SRAP-PCR反應(yīng)體系中,2.5 μL 10×PCR buffer、模板DNA量60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、引物0.3 μmol/L和Taq DNA聚合酶1.25 U。對(duì)優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序的驗(yàn)證結(jié)果表明,優(yōu)化的刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序是穩(wěn)定可行的。
刨花潤(rùn)楠;SRAP-PCR;體系優(yōu)化
刨花潤(rùn)楠(Machilus pauhoi),又名刨花楠、粘柴(福州市)、刨花(廣東?。?,屬樟科(Lauraceae)潤(rùn)楠屬植物,為常綠大喬木,產(chǎn)于長(zhǎng)江以南各省,主要分布在海拔300~1 200 m的山坡及溝谷地帶。刨花潤(rùn)楠全身是寶,是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景的闊葉樹(shù)種,其樹(shù)干通直,生長(zhǎng)迅速,出材量大,6 a生林木可進(jìn)行采伐利用,且其砍伐后萌芽力強(qiáng),更新快。從該樹(shù)種葉片中提取的精油是優(yōu)良的天然香料,具有獨(dú)特藥用價(jià)值,而樹(shù)皮富含樹(shù)脂和橡膠,種子含油率高達(dá)50%,可作為優(yōu)良的工業(yè)潤(rùn)滑油,或供制皂及制蠟用[1-2]。此外,刨花潤(rùn)楠樹(shù)形高大美觀,枝繁葉茂,四季常青,嫩葉呈粉紅色或紅棕色,也是優(yōu)良的園林綠化樹(shù)種[3]。目前,對(duì)刨花潤(rùn)楠的研究主要集中在生物量結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)規(guī)律、育苗技術(shù)和觀賞性等方面[4-7],有關(guān)刨花潤(rùn)楠種質(zhì)資源保存與開(kāi)發(fā)利用、種質(zhì)分子鑒別等方面尚未見(jiàn)報(bào)道。
SRAP分子標(biāo)記是由美國(guó)加州大學(xué)Li與Quiros博士提出的一種研究DNA多態(tài)性的有效新型分子標(biāo)記技術(shù)[8]。該分子標(biāo)記穩(wěn)定可靠,信息量大,多態(tài)性及共顯性高,引物具有通用性,且該技術(shù)操作簡(jiǎn)單,成本低廉[9]。目前在作物和蔬菜的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、比較基因組學(xué)和品種分子鑒定等研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[10-15]。近年來(lái),逐步應(yīng)用于林木的指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析及指紋檢索等研究中[16-20]。本試驗(yàn)通過(guò)摸索適于刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR擴(kuò)增的技術(shù)條件,以期為SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于樟科潤(rùn)楠屬植物的鑒別及遺傳多樣性的研究提供技術(shù)參考。
1.1 試驗(yàn)材料與試劑
供試的刨花潤(rùn)楠種子采于廣西壯族自治區(qū),在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北苗圃播種育苗。隨機(jī)選取10個(gè)家系(分別為廣西賀州4個(gè)家系,廣西興安4個(gè)家系,廣西昭平2個(gè)家系),每個(gè)家系選取1株生長(zhǎng)良好的幼苗,苗齡為1.5 a生,取幼嫩葉片,在–80 ℃下保存?zhèn)溆?,用于提取總DNA。電泳檢測(cè)時(shí)選用DL2000 DNA Marker(M)進(jìn)行比對(duì)參照物,所選用SRAP引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 DNA提取及檢測(cè) 李榮華等[21]認(rèn)為,在提取DNA過(guò)程中加入預(yù)冷異丙醇和24 : 1的氯仿:異戊醇混合液,可有效去除葉片中所含的多酚、蛋白質(zhì)、脂類、多酯的角質(zhì)等不利于DNA提取的干擾物質(zhì),同時(shí)適當(dāng)加大β-巰基乙醇的用量,可進(jìn)一步減少褐變。本實(shí)驗(yàn)對(duì)OMEGA試劑盒(EasyPure Plant Genomic DNA Kit)加以調(diào)整改進(jìn)(在提取DNA過(guò)程中加入預(yù)冷異丙醇和24 : 1的氯仿:異戊醇混合液)后,提取基因組總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量后,稀釋至所需質(zhì)量體積濃度(25 ng /μL),在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 引物的篩選 按照隨機(jī)抽樣方式從100對(duì)SRAP引物中選取10對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,選擇條帶較為豐富的2對(duì)引物組合Me3(5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3')/Em4(5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3')和Me4(5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3')/Em4(5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3')進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[22]。
1.2.3 SRAP-PCR的基礎(chǔ)擴(kuò)增程序 PCR反應(yīng)在多功能PCR儀中進(jìn)行,循環(huán)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后再72 ℃延伸10 min;10 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察和記錄。
1.2.4 SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化驗(yàn)證選擇5個(gè)25 μL的PCR 擴(kuò)增體系,采用模板2、4號(hào)樣本DNA(DNA樣品點(diǎn)樣點(diǎn)為2 μL),選用引物組合(Me3/Em4、Me4/Em4)進(jìn)行擴(kuò)增,從中篩選出1個(gè)較好的反應(yīng)體系;在此體系的基礎(chǔ)上,針對(duì)影響PCR 反應(yīng)的6個(gè)因素,分別對(duì)DNA模板用量、引物、dNTP和Mg2+摩爾體積濃度、Taq DNA聚合酶和退火溫度設(shè)置不同的梯度(表1)進(jìn)行單因素試驗(yàn),在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)所產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行直觀分析,以確定最佳反應(yīng)體系[23]。并運(yùn)用不同引物組合(Me18/Em7、Me18/Em6和Me24/Em9)分別對(duì)刨花潤(rùn)楠8個(gè)不同家系樣品(選取了上述10個(gè)家系中的8個(gè),分別是廣西賀州4個(gè)家系,廣西興安中的2個(gè)家系,廣西昭平2個(gè)家系)進(jìn)行反應(yīng)體系的驗(yàn)證。
表1 SRAP反應(yīng)體系梯度設(shè)置
2.1 刨花潤(rùn)楠葉片總DNA提取
由圖1可以看出,刨花潤(rùn)楠總DNA的電泳圖譜清晰完整,片段大于20 kb,無(wú)降解拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生,無(wú)明顯RNA存在,點(diǎn)樣孔附近無(wú)滯留物。經(jīng)估算,蛋白快速檢測(cè)儀檢測(cè)所提取DNA的OD260/ OD280值均為1.73~1.92,質(zhì)量體積濃度為20~80 ng/μL,符合SRAP-PCR模板要求。
2.2 刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
2.2.1 DNA模板用量 模板DNA用量直接影響SRPA-PCR擴(kuò)增結(jié)果的條帶。對(duì)刨花潤(rùn)楠總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,DNA模板量對(duì)反應(yīng)的影響相對(duì)較大,但DNA用量在10~80 ng時(shí)均可擴(kuò)增出條帶,而以模板用量為60~80 ng時(shí)最為穩(wěn)定;模板用量低于60 ng時(shí),擴(kuò)增條帶較少。結(jié)合本試驗(yàn)的結(jié)果,確定60 ng為最佳DNA模板用量。
圖1 刨花潤(rùn)楠10株不同幼苗基因組總DNA提取電泳圖
圖 2 基因組DNA模板量對(duì)刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)的影響
2.2.2 Taq DNA聚合酶濃度 Taq DNA聚合酶的活性和用量對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)影響較大。由圖3可以看出,0.25~2.00 U都可以得到擴(kuò)增條帶,聚合酶用量過(guò)低時(shí),PCR反應(yīng)無(wú)法完全進(jìn)行,條帶較為模糊;1.25~1.50 U時(shí)效果最好,擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性好、多態(tài)性高;隨著酶用量增大,易產(chǎn)生部分非特異性產(chǎn)物且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。據(jù)此,本試驗(yàn)最終采用的Taq酶適宜用量為1.25 U。
2.2.3 Mg2+濃度 Mg2+摩爾體積濃度是影響SRAPPCR反應(yīng)的主要因素之一。本研究中對(duì)不同摩爾體積濃度的Mg2+進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,結(jié)果(圖4)表明,Mg2+摩爾體積濃度對(duì)反應(yīng)的影響較為明顯,當(dāng)Mg2+為0時(shí)無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn);隨著Mg2+的增加,擴(kuò)增條帶亮度明顯增大;當(dāng)增至2.0 mmol/L時(shí),條帶清晰,此時(shí)效果最佳;當(dāng)Mg2+為3.6 mmol/L,產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶模糊且特異性差。故選擇2.0 mmol/L為最佳。
圖 3 TaqDNA聚合酶量對(duì)刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)的影響
圖 4 Mg2+摩爾體積對(duì)刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)的影響
2.2.4 dNTP濃度 dNTP是SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原料。由圖5 可知,當(dāng)dNTP為0.125~0.325 mmol/ L時(shí),都能擴(kuò)增出條帶, dNTP介于0.125~0.225 mmol/L之間時(shí),擴(kuò)增條帶相對(duì)較少且較為模糊,當(dāng)dNTP為0.225 mmol/L時(shí),此時(shí)擴(kuò)增條帶最多且最為清晰;dNTP大于0.225 mmol/L,隨著摩爾體積濃度增加,擴(kuò)增條帶逐漸減弱。據(jù)此,本試驗(yàn)最終確定dNTP的摩爾體積濃度為0.225 mmol/L。
2.2.5 引物濃度 引物的濃度直接影響PCR擴(kuò)增效果。由圖6可知,當(dāng)引物低于0.2 μmol/L,擴(kuò)增產(chǎn)物較少;當(dāng)引物在0.3~0.5 μmol/L時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物條帶多且條帶清晰穩(wěn)定。之后,隨著引物增加,擴(kuò)增條帶清晰度降低。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果,將適宜的引物摩爾體積確定為0.3 μmol/L。
圖 5 dNTP摩爾體積濃度對(duì)刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)的影響
圖 6 引物摩爾體積對(duì)刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)的影響
2.2.6 退火溫度 退火溫度直接影響引物與模板DNA的特異性結(jié)合能力。由圖7可知,本試驗(yàn)中,當(dāng)退火溫度為54.7~56.9 ℃時(shí),擴(kuò)增出的譜帶多且清晰明亮,故確定PCR反應(yīng)體系中退火溫度為56 ℃。在引物篩選時(shí),針對(duì)不同引物退火溫度可做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
2.2.7 SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證 綜合以上各試驗(yàn)及所獲結(jié)果,從擴(kuò)增產(chǎn)物條帶穩(wěn)定性和節(jié)約成本角度考慮,刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為:25 μL的SRAP-PCR反應(yīng)體系中,2.5 μL 10×PCR buffer、模板DNA量60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、引物0.3 μmol/L和Taq DNA聚合酶1.25 U。運(yùn)用不同引物組合(Me18/Em7、Me18/Em6和Me24/Em9)分別對(duì)刨花潤(rùn)楠8個(gè)家系樣品進(jìn)行驗(yàn)證(圖8),檢驗(yàn)結(jié)果表明引物能對(duì)絕大多數(shù)的個(gè)體擴(kuò)增出清晰譜帶,說(shuō)明優(yōu)化的刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序是穩(wěn)定可行的。
圖 7 退火溫度對(duì)刨花潤(rùn)楠SRAP-PCR反應(yīng)的影響
圖8 應(yīng)用SRAP-PCR優(yōu)化體系對(duì)刨花潤(rùn)楠不同樣本進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)
本試驗(yàn)使用omega試劑盒,采用改良CTAB法提取刨花潤(rùn)楠的基因組DNA,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在提取過(guò)程中,加入24 : 1的氯仿:異戊醇混合液充分振蕩混勻后,在18~20 ℃環(huán)境中離心,可有效提高DNA得率及質(zhì)量。
對(duì)于不同的林木材料,擴(kuò)增體系所用的DNA模板量、Taq 聚合酶、Mg2+、dNTP、引物摩爾體積濃度差異均很大,本試驗(yàn)所得到的SRAP-PCR擴(kuò)增體系與麻瘋樹(shù)(Jatropha carcas)[24]、石斛(Dendrobium nobile)[25]、楊樹(shù)(Populussp.)[26]、油茶(Camellia oleifera)[27]等的擴(kuò)增體系及循環(huán)條件都有所不同,這可能與不同材料的基因組和材料本身的特殊性以及對(duì)試驗(yàn)結(jié)果條帶的判斷具有主觀性等有關(guān),因而需要對(duì)PCR體系進(jìn)行不斷優(yōu)化。PCR循環(huán)條件中的退火溫度對(duì)反應(yīng)影響較大,該反應(yīng)中退火溫度相比其他已報(bào)道麻瘋樹(shù)、石斛、油茶、楊樹(shù)等植物偏高,篩選出的適宜退火溫度(56 ℃)與理論退火溫度(50 ℃)[28]存在較大差異。但同時(shí)退火溫度過(guò)高或過(guò)低都不能得到良好的擴(kuò)增產(chǎn)物;擴(kuò)增體系中DNA模板量和Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)的影響相對(duì)較大,微量變化就有可能導(dǎo)致SRAP-PCR的結(jié)果發(fā)生較大變化,合理調(diào)整DNA模板和Mg2+摩爾體積濃度對(duì)反應(yīng)的擴(kuò)增很重要。
利用本試驗(yàn)優(yōu)化所得的SRAP-PCR反應(yīng)體系,對(duì)刨花潤(rùn)楠23個(gè)種源進(jìn)行SRAP擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果表明在不同種源的刨花潤(rùn)楠中均能獲得清晰穩(wěn)定的條帶,不同種源間表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性[29]。由此可見(jiàn),該反應(yīng)體系可用于刨花潤(rùn)楠的遺傳多樣性分析。
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Establishment and Optimization of SRAP-PCR System forMachilus pauhoi
ZHOU Peng1,2LIN Wei2ZHOU Xiangbin2CHEN Xiaoyang2
(1.Guangdong Eco-engineering Polytechnic, Guangzhou,Guangdong 510520, China; 2. College of Forestry and Landscape Architecture, Sourth China Agricultural University/Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, Guangzhou, Guangdong 510642, China)
Machilus pauhoiis a tree specie with variety of economic value and development prospects. This study aimed to establish an optimized SRAP-PCR system forM. pauhoi,and the young leaves of the 1.5 years old seedlings were used as test materials. Six quality factors including the template DNA, primer concentration, dNTP concentration, Mg2+concentration, Taq DNA polymerase, and annealing temperature were optimized forM. pauhoiSRAP-PCR assay. The obtained results suggested a optimized reaction system of SRAP-PCR (total 25 μL) involving 2.5 μL 10×PCR buffer, 60 ng DNA, 2.0 mmol/ L Mg2+, 0.225 mmol/L dNTP, 0.3 μmol/L primer, 1.25 U Taq DNA polymerase. The verification results showed that the optimized SRAP-PCR reaction system and amplifcation program were stable and feasible.
Machilus pauhoi;SRAP-PCR;system optimization
S718.43,S792.23
:A
:2096-2053(2017)04-0029-05
“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目“刨花潤(rùn)楠和黃樟良種選育研究”(2012BAD01B04);廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目“楝科、樟科優(yōu)質(zhì)速生樹(shù)種良種選育和高效栽培技術(shù)研究與示范”(2011KJCX002)。
周鵬(1989— ),男,助教,主要從事林木遺傳育種研究,E-mail:zhoupeng_0119@163.com。
陳曉陽(yáng)(1958— ),男,教授,主要從事林木良種選育與生物技術(shù)研究,E-mail:xychen@scau.edu.cn。