水稻根際固氮菌N X-2的分離鑒定及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

杜 宇，李來梅，雷 瀟，杜東霞，尹紅梅，劉 標(biāo)，許 雋

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

水稻根際固氮菌N X-2的分離鑒定及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

杜 宇，李來梅，雷 瀟，杜東霞，尹紅梅，劉 標(biāo)，許 雋

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

篩選高效固氮能力的植物根際促生菌是研發(fā)微生物肥料的關(guān)鍵。研究從水稻根際土壤中分離篩選得到一株固氮菌NX-2，利用乙炔還原法測(cè)定其固氮酶活可達(dá)16.18 μmol /(mL·h) （以C2H4濃度計(jì)）。通過形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA序列分析，菌株NX-2被鑒定為褐球固氮菌。進(jìn)一步研究其生長特性，結(jié)果顯示最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃、初始pH值6.5、接種量3%。

水稻根際；固氮微生物；分離；鑒定；培養(yǎng)條件優(yōu)化

氮是水稻生長發(fā)育的必要營養(yǎng)元素，自然狀態(tài)下土壤中的氮素含量很難滿足水稻對(duì)養(yǎng)分的需求。但是依照目前粗放型的施肥習(xí)慣，稻田施加的氮肥被水稻吸收利用的效率并不高，而且氮肥容易在土壤中大量殘留，進(jìn)而污染環(huán)境[1]?？諝庵写罅康匾杂坞x狀態(tài)存在，不能被生物體直接利用，固氮微生物能夠利用體內(nèi)特殊的固氮酶把空氣中的氮?dú)膺€原成植物可利用的分子態(tài)氨[2]。在植物根際中也存在一類能保護(hù)和促進(jìn)植物生長發(fā)育的細(xì)菌，被稱為植物根際促生細(xì)菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR），約有2%～5%的根際細(xì)菌是PGPR[3]。植物根際固氮菌是一類重要的PGPR，定植于根表和近根土壤中，除了固氮作用外，還具有促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的礦化、分泌植物激素等促生長的作用[4]。自生固氮菌種類很多，主要包括圓褐固氮菌、貝氏固氮菌、巴斯德固氮梭菌等[5]。在法國、美國等國家已經(jīng)有研究證明把固氮螺菌接種到玉米上，可取代20%～30%的氮肥，同時(shí)增產(chǎn)10%～20%[6]。目前，固氮微生物肥料的研究方向正在從研制豆科植物根瘤菌劑轉(zhuǎn)向禾谷類作物的固氮肥料上來，其中禾谷類自生固氮菌和聯(lián)合固氮菌的選育是重點(diǎn)和難點(diǎn)[7]。因此，研究以水稻根際土壤為材料從中篩選出一株具高固氮酶活性的菌株，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定后，對(duì)該菌株的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為禾谷類固氮肥料的研制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻根際土壤樣品采自湖南寧鄉(xiāng)回龍鋪，取樣時(shí)先去掉地表土，選擇附有水稻根系的土壤。阿須貝無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO40.1 g，CaCO35 g，雙蒸水1 000 mL，pH值為7.0；固體培養(yǎng)基加2 %的瓊脂粉，半固體培養(yǎng)基加0.5 %瓊脂粉。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，雙蒸水1 000 mL，pH值為7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固氮菌的分離篩選 取10 g附在水稻根上的松散土，溶于90 mL無菌水中，搖床振蕩30 min制成菌懸液，采用10倍稀釋法，把各稀釋倍數(shù)的菌液涂布在阿須貝無氮培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，將形態(tài)不同的單菌落通過平板劃線分離純化。

1.2.2 固氮酶活的測(cè)定 采用乙炔還原法，將固氮菌接種于含有10 mL半固體阿須貝培養(yǎng)基的25 mL血清瓶中，28℃培養(yǎng)2～3 d，把血清瓶蓋更換成橡膠塞，用無菌注射器抽取1/10體積的空氣，注入等體積的乙炔，28℃繼續(xù)培養(yǎng)1～4 d，抽取50 μL混合氣體注入氣相色譜儀，測(cè)定乙烯生成量，酶活單位用單位體積的發(fā)酵液在單位時(shí)間內(nèi)生成乙烯的微摩爾數(shù)表示，參照文獻(xiàn)[8]測(cè)定固氮酶活。

1.2.3 菌種鑒定 提取固氮菌總DNA，以細(xì)菌16S rDNA通用引物27-F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'；1492-R：5'-AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物純化后送樣上海生工進(jìn)行DNA測(cè)序，序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 菌種生長特性分析 按1%的接種量將菌株NX-2種子液轉(zhuǎn)接至100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別置于24、26、28、30、32℃搖床上發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的菌數(shù)，確定最佳培養(yǎng)溫度；調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在最佳培養(yǎng)溫度條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的菌數(shù)，確定最佳初始pH值；在最佳培養(yǎng)溫度和初始pH值條件下，分別按1%、2%、3%、4%、5%接種，發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的菌數(shù)，確定最佳接種量。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根際固氮菌的分離篩選

在阿須貝無氮培養(yǎng)基上初篩得到了多株形態(tài)、顏色各異的固氮菌株。其中，菌株NX-2在無氮培養(yǎng)基上長勢(shì)較好，如圖1所示，菌落為圓形半透明，邊緣整齊，表面濕潤，不易挑起，能夠產(chǎn)生粘液。在顯微鏡鏡下觀察為桿狀，有莢膜。

圖1 固氮菌株NX-2的菌落形態(tài)

2.2 菌株NX-2固氮酶活性

固氮酶活是評(píng)價(jià)固氮菌性能的重要指標(biāo)，固氮酶可以催化乙炔還原成乙烯，用氣相色譜儀檢測(cè)乙烯的生成量，間接測(cè)定固氮酶活性。在密封的血清瓶中注入乙炔后，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d檢測(cè)酶活性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)1～4 d檢測(cè)固氮酶活分別為0.87、4.30、15.13、16.18 μmol/(mL·h) （以C2H4濃度計(jì)），說明菌株NX-2具有較高的固氮酶活性。

圖2 固氮菌株NX-2的固氮酶活性

2.3 菌種鑒定

對(duì)菌株NX-2進(jìn)行常規(guī)的生理生化特性分析，結(jié)果表明該菌株革蘭氏染色和氧化酶反應(yīng)為陰性，淀粉水解、過氧化氫酶、M.R.、V.P.、硫化氫反應(yīng)均為陽性，表明該菌株可以利用葡萄糖、果糖、甘露醇等碳源。這些生理生化特性與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中對(duì)褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）的描述一致。提取菌株NX-2的基因組DNA，PCR擴(kuò)增16 S rDNA片段，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)NX-2與Azotobacter chroococcum AM12A菌株（GenBank：AB430880）的同源性為99.6%，結(jié)合生理生化特性確定NX-2菌株為褐球固氮菌。

2.4 NX-2菌株的最適培養(yǎng)條件

2.4.1 最佳培養(yǎng)溫度 分別在24～32℃溫度條件下對(duì)菌株NX-2培養(yǎng)24 h，如圖3所示，在28～32℃條件下活菌數(shù)均超過108CFU/mL，其中當(dāng)溫度為28℃時(shí)達(dá)到2.73×108CFU/mL，活菌數(shù)最高。故可認(rèn)為菌株NX-2的最佳培養(yǎng)溫度為28℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株NX-2生長的影響

2.4.2 最佳初始pH值 分別在初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的條件下對(duì)菌株NX-2進(jìn)行培養(yǎng)，如圖4所示，菌株NX-2在pH值6.0～7.0范圍內(nèi)生長較好，說明該菌株有一定的耐酸能力。因此，將初始pH值設(shè)定為6.5，菌株NX-2活菌數(shù)最高，達(dá)到3.4×108CFU/mL。

圖4 初始pH值對(duì)菌株NX-2生長的影響

2.4.3 最佳接種量 如圖5所示，當(dāng)接種量為1%～5%時(shí)，活菌數(shù)分別為2.93×108、4.83×108、6.10×108、6.57×108、6.53×108CFU/mL。隨著接種量的增加，菌株NX-2的活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)；但當(dāng)接種量超過3%時(shí)，活菌數(shù)增加不明顯，因此選擇3%作為菌株NX-2的最佳接種量。

圖5 接種量對(duì)菌株NX-2生長的影響

3 結(jié)論與討論

從水稻根際土壤中分離篩選得到一株固氮菌NX-2，利用乙炔還原法測(cè)定其培養(yǎng)4 d時(shí)固氮酶活為16.18 μmol /(mL·h) （以C2H4濃度計(jì)），具有較高的固氮酶活性。通過生理生化特性和16 S rDNA序列分析，菌株NX-2被鑒定為褐球固氮菌。褐球固氮菌屬于假單胞菌目假單胞菌科褐球固氮菌屬，已經(jīng)有研究表明褐球固氮菌可以用于微生物肥料。對(duì)固氮菌NX-2的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃、初始pH值6.5、接種量3%。菌株NX-2有一定的耐酸能力，而目前湖南稻田土壤普遍為弱酸性和酸性，十分有利于菌株NX-2的定植。同時(shí)，該研究為水稻固氮促生微生物菌肥的研發(fā)提供了菌種資源。研究顯示，大部分根際固氮微生物還有促進(jìn)作物生長的能力，后續(xù)將朝著這一方向努力，研究菌株NX-2對(duì)水稻的促生效果。

[1] 巨曉棠，谷保靜. 我國農(nóng)田氮肥施用現(xiàn)狀、問題及趨勢(shì) [J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2014，20（4）：783-795.

[2] 沈世華，荊玉祥. 中國生物固氮研究現(xiàn)狀和展望[J]. 科學(xué)通報(bào)，2003，48（6）：535-540.

[3] 徐洪海. 植物生長促進(jìn)菌（PGPR）對(duì)大豆種子發(fā)芽效果初探[J].當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè)，2007，（1）：27-28.

[4] 胡江春，薛德林，馬成新，等. 植物根際促生菌（PGPR）的研究與應(yīng)用前景[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（10）：1963-1966.

[5] 郭維烈. 實(shí)用微生物技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1991.

[6] 沈阿林，王永歧. 微生物肥料研發(fā)現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，（4）：34-36.

[7] 祝凌云. 水稻根際促生菌的篩選及對(duì)水稻的促生作用[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[8] 趙 斌，何紹江. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002.

（責(zé)任編輯：成 平）

Isolation, Identification and Optimization of culture conditions of Nitrogen-Fixing Bacteria NX-2 from Rice Rhizosphere

DU Yu，LI Lai-mei，LEI Xiao，DU Dong-xia，YIN Hong-mei，LIU Biao，XU Jun
（ Hunan Academy of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

It is a key issue to screen the rhizosphere promoting bacteria of high efficient nitrogen fixing ability for the development of microbial fertilizer. In this study a nitrogen-fixing bacteria NX-2 was isolated from rice rhizosphere soil. Nitrogenase activity was measured by acetylene reduction at 16.18 μmol/(mL·h) calculated C2H4concentration. Through morphological observation, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis, the strain NX-2 was identi fi ed as Azotobacter. Its growth characteristics were further studied, the results showed that the optimal fermentation condition was the initial temperature 28℃, pH 6.5, inoculum size 3%.

rice rhizosphere; nitrogen- fi xing bacteria; isolation; identi fi cation; optimization of culture conditions

S144.5

：A

：1006-060X（2017）07-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.007.001

2017-05-08

湖南省自然科學(xué)基金（2015JJ3084）

杜 宇（1979-），男，湖南長沙市人，工程師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物相關(guān)研究。

許 雋