電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響※

● 李夢瑤 李向榮 高瓊玨 劉 戀

電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響※

● 李夢瑤*李向榮▲高瓊玨 劉 戀

目的：觀察電針四關(guān)穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響。方法：將120只SD大鼠隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組及電針組，每組劃分成24h、48h和72h三個亞組，各10只。模型組及電針組用線栓法建立大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型。電針組各亞組在造模成功后即刻行電針四關(guān)穴干預(疏密波，20min/次)，48h組在24h再次電針干預，72h組在24h和48h各電針干預1次。在相應時間點采集抗凝腹主動脈血分離單個核細胞，用流式細胞術(shù)檢測其表型標記為CD34+/KDR+細胞的EPCs含量。各組均在造模后即刻、24h、48h和72h按Longa評分進行神經(jīng)功能評分。結(jié)果：造模后24h，電針組Longa評分有所下降，與模型組比較無明顯差異(P>0.05)，模型組血中EPCs含量較其它各組顯著增加(P<0.01)。造模后48h，電針組Longa評分較模型組明顯降低(P<0.05)，其血中EPCs含量較其它各組明顯增加(P<0.01)。72h時，電針組Longa評分較模型組明顯降低(P<0.05)，其血中EPCs含量與正常組及假手術(shù)組比較無明顯差異(P>0.05)，而模型組仍高于其它各組(P<0.01)。結(jié)論：電針四關(guān)穴能讓局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性EPCs含量增加，并能促進恢復其神經(jīng)功能，其作用機理有待進一步深入研究。

腦缺血再灌注 電針 內(nèi)皮祖細胞 神經(jīng)功能缺損

目前，針灸調(diào)控內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以修復損傷血管及促進血管再生已成為缺血性腦血管病治療的熱點之一。通過利用電針動員骨髓中的內(nèi)源性EPCs遷移入血、歸巢至缺血性卒中后的腦損傷區(qū)域，從而促進血管新生，繼而改善血供，可能成為一條保護缺血腦組織并促進其神經(jīng)功能恢復的新手段。本文將就電針與腦缺血再灌注損傷后機體內(nèi)EPCs含量及神經(jīng)功能缺損程度的關(guān)系進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 動物來源 健康SD雄性大鼠150只，湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(SPF級)，大鼠許可證號0617462。購買回來嚴格按照規(guī)則適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%～70%，體重250～300g，鼠齡9周，自由攝食飲水。

1.2 造模

1.2.1 造模方法 將禁食24h(不禁水)的大鼠參照改良Longa線栓法制備左側(cè)大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型大鼠模型：①稱重并腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg)麻醉；②仰臥固定后頸部消毒，正中切開鈍性分離后暴露左側(cè)頸總動脈，將頸內(nèi)動脈、頸外動脈及翼腭動脈分離；③結(jié)扎頸總和翼腭動脈，從頸外動脈處將預備的線栓插入頸內(nèi)動脈，在進深至大腦中動脈的起始端時，當插入約(18.5±0.5)mm時遇阻力則止，在用頸外動脈掛線結(jié)扎固定后縫合傷口，造成左側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的局灶性缺血；④缺血2h后，將栓線拔出建立缺血-再灌注模型。將術(shù)后老鼠放置在干燥清潔的加熱墊上，室溫控制在26～30℃。1.2.2 模型成功標準 待大鼠完全清醒后，參照經(jīng)典Zea-Longa評分標準(5級4分法)進行神經(jīng)功能評分：0分(不存在偏癱肢體功能缺失)；1分(不能完全伸展右前肢)；2分(爬行時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，追尾)；3分(爬行時向右側(cè)傾倒)；4分(不能自主行走，或伴有意識障礙)。

評分為1～3分為成功模型，入選實驗。如果術(shù)中出血量大、出現(xiàn)呼吸異常、蛛網(wǎng)膜下腔出血或大鼠還未到時間點提前死亡者剔除，并將相應只數(shù)補足。

1.3 分組及處理方法 本實驗采用先造模后分組的方法，隨機抓取大鼠后用藍色記號筆在鼠尾標記數(shù)字，用隨機數(shù)字表進行分組，隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組及電針組，每組劃分成24h、48h和72h三個亞組，每組10只。均在造模后即刻、24h、48h和72h進行神經(jīng)功能評分并在造模后24h、48h和72h分別采集腹主動脈血。

A.正常組：予常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

B.假手術(shù)組：分離頸部動脈，不插栓線、不結(jié)扎，在將切口縫合后，將其同期同步進行飼養(yǎng)；該組不行電針治療，僅與電針組同時捆綁在鼠板上20min。

C.模型組：在造模后只與電針組同時間捆綁于鼠板上20min而不行電針治療。

D.電針組：電針組在大鼠未清醒時選取大鼠四關(guān)穴行針刺后接電針干預。三個亞組均在造模后即刻電針干預1次，48h組在造模后24h再次電針干預1次，72h組在造模后24h及48h再次電針干預1次。

1.4 選穴依據(jù) 四關(guān)一詞始于《靈樞·九針十二原》，明代徐鳳《針灸大全》注曰：“四關(guān)者占，五臟有六腑，六腑有十二原，十二原出于四關(guān)，太沖、合谷是也?！钡谝淮螌⑺年P(guān)定位為太沖、合谷。太沖為足厥陰肝經(jīng)的原穴。古文有云：“諸風掉眩，皆屬于肝”，治療中風病，應從肝論治，因其病位在腦，而太沖穴所在的足厥陰經(jīng)是唯一一條循行于頭部的陰經(jīng)，肝腦相通，故刺激該穴可推動全身氣血運行，平調(diào)陰陽寒熱虛實，起到醒神開竅，痛經(jīng)活絡的作用。合谷是手陽明大腸經(jīng)的原穴，是臟腑原氣經(jīng)過和留止的穴位，在穴性上，合谷穴可補可散，益氣升陽，行氣散滯，開竅啟閉，鎮(zhèn)驚安神，可用于厥證、脫證、閉證等急癥。太沖、合谷兩穴升降相宜，氣血相依，臟腑相合，陰陽相配，此乃一組治療中風病的經(jīng)典絕妙配穴。

1.5 治療方法 用華佗牌0.25mm×13mm毫針在四關(guān)穴(兩側(cè)的“合谷”穴及“太沖”穴)進針3mm后連接華佗牌電針治療儀(“太沖”接負極，“合谷”接正極，)以疏密波(電流強度1mA，頻率為2/15Hz)持續(xù)刺激20min。穴位的選取參照李忠仁主編的《實驗針灸學》及華興邦主編的大鼠穴位圖譜[1]。

1.6 試劑及儀器

1.6.1 主要試劑 FITC標記的小鼠抗大鼠CD34(AbD serotec)，小鼠VEGFR-2單克隆抗體(Abcam)，陰性對照小鼠IgG-FITC及PE標記的羊抗鼠IgG(晶美生物)；淋巴細胞分解液、4%多聚甲醛、2%小牛血清及PBS磷酸鹽緩沖液(長沙駿宏)。

1.6.2 主要儀器 FC-500流式細胞儀(美國貝克曼公司)；高速低溫離心機1-14型(德國Sigma公司)；南京前沿儀器設備有限公司生產(chǎn)純水儀；平安醫(yī)械生產(chǎn)的真空肝素鈉抗凝管；冰箱BCD-218A/B(海爾股份有限公司)；移液器(芬蘭DRAGON公司)；華佗牌0.25×13mm毫針及SDZ-V型電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.7 檢測步驟

1.7.1 血樣的采集 在完成規(guī)定時間的治療觀察后，重新依據(jù)上述實驗方法在造模后的24、48和72h分別對各組動物進行麻醉后的固定。每個時間點正常組與假手術(shù)組及模型組與針刺組同時剖腹分離腹主動脈，用肝素鈉抗凝管采集腹主動脈血3ml，做好時間及代號標記后放置在4℃冰箱內(nèi)保存待分離。

1.7.2 血樣的分離 ①先取淋巴細胞分離液放入滅菌管中；②按照1：1比例將腹主動脈血與注射用生理鹽水混勻后添置到淋巴細胞分離液的液面上；③以400g(1500轉(zhuǎn)/分)的速度，15cm水平轉(zhuǎn)子為半徑離心配平好的標本20分鐘；④離心取出棄血漿層，取乳白色環(huán)狀的淋巴細胞層放到含有2%小牛血清100μl+PBS5ml的普通試管中，充分混勻后再以同樣速度離心20分鐘；⑤4%多聚甲醛固定經(jīng)2次反復清洗離心后所得沉淀；⑥-20℃冰箱中保存，最長可達1個月。

1.7.3 EPCs檢測前準備 ①加抗體孵育以確定方案：標記4只管，管1和管2中各取90μl解凍后標本放入，后將KDR抗體及CD34抗體各5μl添入管1中，同時將二種抗體的同型對照各5μl添入管2中；管3和管4中各取95μl解凍后標本，后在管3中添入CD34抗體5μl，在管4中添入KDR抗體5μl。②確定檢測方案后，將兩只標記好的管中各加入打散后標本90μl，管1再分別取KDR及CD34兩種抗體各5μl，管2再取二種抗體的同型對照各5μl加入，混勻后避光孵育約30分鐘～1小時。③重懸：孵育后兩管均加入PBS600μl充分混勻，再次等速等時離心，棄上清液后加4%多聚甲醛重懸，最后以4°C保存待測。

1.7.4 EPCs檢測 采用流式細胞儀檢測CD34+/KDR+細胞表達雙陽性的細胞，即被標記為EPCs。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評定結(jié)果 腦缺血再灌注后即刻模型組、電針組神經(jīng)功能缺損評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；造模后24h，電針組神經(jīng)功能缺損評分有所下降，與模型組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模后48h，電針組神經(jīng)功能缺損評分降低，與模型組相比，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；72h時，電針組神經(jīng)功能缺損評分降低，與模型組相比，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明造模后大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，而在造模后48h和72h電針組大鼠的神經(jīng)功能恢復程度及其活躍性均優(yōu)于模型組，提示電針四關(guān)穴可以促進腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復。見表1。

表1 各組大鼠不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較(分，±s)

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.01；▲與模型組比較，P<0.05。

2.2 治療后外周血中EPCs含量的變化 每100個細胞中EPCs的個數(shù)為EPCs所占的百分比，造模后24h，模型組血中EPCs含量顯著增加，相較于其它各組，其差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。造模后48h，電針組血中EPCs含量明顯增加，相較其它各組，其差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。造模后72h時，電針組血中EPCs含量和正常組及假手術(shù)組比較其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而模型組仍高于其它各組(P<0.01)。說明電針四關(guān)穴能在大鼠腦缺血損傷后48h更明顯促進其EPCs含量增加。見表2。

表2 各組大鼠不同時間外周血EPCs含量變化比較±s)

注：*與同時段其它組比較,P<0.01。

3 討論

缺血性腦卒中的發(fā)病率逐年上升且日益年輕化，嚴重影響了個人及家庭的身心健康。研究表明，及早改善缺血區(qū)域的血供是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵。而促進腦缺血后半暗帶區(qū)腦組織的血管新生及其側(cè)枝血管的形成，從而改善其血供，可能成為一種保護缺血的腦組織和促進其神經(jīng)功能恢復的新手段[2]。研究證實，在急性的缺血性腦卒中發(fā)生后48h，其外周血中EPCs的數(shù)量和其神經(jīng)功能缺損的嚴重程度呈負性相關(guān)[3-5]。因此，通過動員與增殖骨髓內(nèi)的EPCs并將其遷移入血、歸巢到缺血性卒中后的腦損傷區(qū)域，可促進血管新生、建立缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)，這將可能成為一種改善腦組織供血與促進恢復其神經(jīng)功能的新手段。

針灸療法治療缺血性卒中歷史悠久，其中電針療法可通過發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多途徑的調(diào)節(jié)作用來治療缺血性卒中，作為一種傳統(tǒng)的非藥物治療方法在防治缺血性卒中方面獨具優(yōu)勢[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者的肢體運動功能、神經(jīng)功能缺損程度及日常生活活動能力能通過針刺治療得以明顯改善[8-10]。電針可使缺血性卒中缺血半暗帶區(qū)內(nèi)微血管數(shù)明顯增多，促進血管新生，增加血氧供應，達到治療缺血性卒中的目的。足厥陰的原穴太沖和手陽明的原穴合谷穴即為四關(guān)穴，兩穴升降相宜，氣血相依，臟腑相合，陰陽相配，此乃一組經(jīng)典絕妙配穴。針刺雙側(cè)合谷和太沖穴可以通過交感神經(jīng)來調(diào)節(jié)大腦血管管徑，使腦血流的阻力降低，從而改善顱內(nèi)血液循環(huán)[11-12]。針刺四關(guān)穴能有效地使中風患者的日常生活能力及質(zhì)量得以改善，同時有益于患者更好的回歸于社會[13]。

本研究立于觀察電針四關(guān)穴對局灶性腦缺血大鼠血中EPCs含量及其神經(jīng)功能缺損程度的影響，從結(jié)果中我們不難看出，通過針刺治療后，電針組大鼠的神經(jīng)功能恢復程度及其活躍性均優(yōu)于模型組；而外周血中EPCs的含量在腦缺血損傷后均有所增加，然而再灌注后48h，經(jīng)電針干預后其EPCs含量明顯高于模型組。結(jié)果證明電針四關(guān)穴不僅可以促進腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復，亦能促進其外周血中EPCs含量增加，二者呈正相關(guān)。同時結(jié)果也顯示，電針組24h和72h時血中EPCs含量低于模型組，且與正常組和假手術(shù)組無明顯差異，其機理尚未明確，有學者研究提出這可能與損傷早期機體內(nèi)的炎性反應及VEGF的表達有關(guān)，有待于進一步深入研究和闡明。

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湖南省科技廳資助項目(No.2013109)

李夢瑤，女，醫(yī)學碩士。研究方向：針灸治療腦病的研究。

▲通訊作者 李向榮，男，主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，碩士研究生導師。研究方向：針灸治療腦病的研究。E-mail：txmm819@sohu

湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腦病科(410005)