靶向Dicer的RNA干擾對卵巢癌細胞生物學功能的影響▲

何中慧 盧芳芳 徐 紅 王澤華 遲 博 況 燕*

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學，南寧市530021；3 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬內科醫(yī)院婦產科；武漢市 430074)

靶向Dicer的RNA干擾對卵巢癌細胞生物學功能的影響▲

何中慧1盧芳芳2徐 紅1王澤華3遲 博1況 燕1*

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學，南寧市530021；3 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬內科醫(yī)院婦產科；武漢市 430074)

目的 探討Dicer抑制對卵巢癌細胞A2780增殖和遷移能力的影響，以進一步明確Dicer在卵巢癌生物學行為中的作用。方法 合成Dicer的小干擾RNA(Dicer siRNA)轉染A2780細胞并篩選有效siRNA，實時定量PCR(RT-PCR)檢測Dicer的mRNA的表達，蛋白印跡法檢測Dicer蛋白的表達，MTT檢測細胞生長活力，Transwell小室檢測細胞遷移能力，流式細胞儀測定細胞周期。結果 與未轉染組相比，siRNA1658轉染組Dicer基因mRNA的表達最低，為(0.194±0.002)，明顯低于siRNA1897轉染組的(0.535±0.015)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，但與siRNA334組的(0.251±0.014)相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實時定量PCR結果顯示，以未轉染A2780細胞Dicer mRNA表達水平為100%，siDicer-A2780細胞Dicer的mRNA水平相對下降(0.157±0.012)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。以未轉染A2780細胞Dicer的蛋白表達水平為100%，siDicer-A2780細胞Dicer的蛋白水平相對下降(0.153±0.021)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。在種板后第3天、第4天、第5天，與對照組細胞比較，siDicer轉染的A2780細胞增殖能力增強(P均<0.05)。與對照組轉染siNC的細胞相比，轉染siDicer 96 h后，siDicer-A2780細胞的增殖活性平均上升了23%。細胞周期分析結果顯示siDicer-A2780細胞中G0/G1期占(44.26±0.48)%，S期占(25.05±1.20)%，G2/M期占(21.53±0.77)%；對照組siNC-A2780細胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%，S期占(20.01±1.22)%，G2/M期占(19.80±0.24)%。siDicer-A2780細胞S期和G2/M細胞較對照組明顯增加(P均<0.05)，而G0/G1期細胞則減少(P<0.001)。與對照組siNC-A2780細胞的穿膜細胞數相比，抑制Dicer表達的siDicer-A2780 細胞的穿膜細胞數增加(3.99±0.29)倍(P<0.001)。結論 Dicer基因具有抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲的能力。

卵巢癌；Dicer基因；細胞增殖；細胞侵襲；治療靶點

Dicer屬于核糖核酸酶III(RNaseIII)的家族成員，是微小分子RNA(miRNA)生物合成過程中的關鍵酶。作為miRNA的上游調控因子，Dicer下調可能通過降低miRNA的表達來促進細胞轉化和腫瘤的形成[1]。但目前關于Dicer對卵巢癌細胞生物學功能影響的報道甚少。為進一步明確Dicer與卵巢腫瘤生長和轉移的關系，通過靶向干擾Dicer的小干擾RNA(siRNA)沉默Dicer基因，抑制Dicer基因在卵巢癌細胞A2780中的表達，探討Dicer抑制對卵巢癌細胞生物學功能的影響?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 人卵巢癌細胞A2780購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),RPMl640培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Gibco公司，逆轉錄酶試劑盒和熒光染料SYBR Green Real time PCR反應液購自日本Toyobo公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，兔抗人H3多克隆抗體購自美國Bioworld Technology，鼠抗人Dicer多克隆抗體購自美國abcam公司，辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)標記二抗購自美國Santa Cmz公司，Bradford蛋白定量試劑盒和增強化學發(fā)光ECL顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所，PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 小干擾RNA(siRNA) 小干擾RNA(siRNA)質粒載體Dicer-siRNA的設計合成，序列如表1。

表1 siRNA載體Dicer-siRNA的設計合成

1.3 A2780細胞轉染 本實驗以Dicer-siRNA轉染的A2780細胞作為Dicer-siRNA組(A2780-siDicer)，以negative control-siRNA轉染的A2780細胞作為非特異性序列轉染組(A2780-siNC)，不作處理的作為未轉染對照組(A2780)。卵巢癌細胞株A2780培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育箱內傳代培養(yǎng)。收集細胞，將A2780細胞以5×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，次日，細胞貼壁生長匯合至50%時，取Dicer-siRNA1658、Dicer-siRNA334、Dicer-siRNA1879、negative control-siRNA各100 pmol和脂質體lipofectamine 2000 5 μ混勻并轉染細胞，未轉染對照組則加入1 640培養(yǎng)液，具體操作按Lipofectamine 2 000說明書要求進行。

1.4 Dicer mRNA的表達 Trizol法提取各組細胞總RNA，按Toyobo逆轉錄試劑盒說明書將mRNA逆轉錄為cDNA。Dicer的上游引物為：5′- GTGGTTCGTTTTGATTTGCCC-3′，下游引物為：5′- CGTGTTGATTGTGACTCGTGGA -3′。以β-actin為內參，上游引物5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物：5′- TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行檢測。反應條件，95℃1 min，95℃15 s，58℃15 s，72℃45 s，40個循環(huán)，用2-△△ct法計算Dicer /β-actin比值。實驗結束后分析熔解曲線，以鑒定產物的單一性。在PCR過程中設立無模板陰性對照。本實驗重復3次。

1.5 Dicer蛋白的表達 提取各組細胞總蛋白，Bradford方法測定蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并將蛋白轉至硝酸纖維素膜，鼠抗人Dicer多克隆抗體(1 ∶1 000；abcam) 4℃孵育過夜，HRP標記二抗(1 ∶5 000；Santa Cruz)室溫孵育1 h后ECL化學發(fā)光觀察，以β-actin作為等量上樣的標準，結果應用條帶密度分析軟件Quantity One軟件分析，計算 Dicer/β-actin比值表示Dicer蛋白的表達水平。本實驗重復3次。

1.6 細胞生長活力 取各組對數生長期細胞，調整細胞密度按2×103/孔接種96孔板，共接種5板。每日取1塊板，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150μL，用酶標儀以570 nm波長測量各孔吸光度(A570)值，計算光密度(OD)值，連續(xù)5 d，繪制細胞的生長曲線。

1.7 細胞體外遷移能力的測定 采用直徑6.5 mm、孔徑8 μm的Transwell小室進行細胞遷移能力的檢測，結晶紫染色，顯微鏡下計數穿膜細胞數，每個樣本隨機計數5個視野，取平均值。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.8 流式細胞儀測定細胞周期 采用流式細胞儀測定細胞生長周期，分析DNA含量，應用相關軟件分析G0期、S期和G2期的細胞比例。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計學的分析，計量資料結果用(x±s)表示, 兩組數據的比較采用t檢驗，兩組以上數據采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Dicer siRNA轉染A2780細胞并篩選有效siRNA 靶向干擾Dicer的三種siRNA334、siRNA1658、siRNA1897分別轉染到A2780細胞中，實時定量PCR技術檢測目的基因Dicer mRNA的表達。與未轉染組相比，siRNA1658轉染組Dicer基因mRNA的表達最低，為(0.194±0.002)，明顯低于siRNA1897轉染組的(0.535±0.015)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；與siRNA334組的(0.251±0.014)相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。因此，本研究選擇siRNA1658進行后續(xù)實驗。

Dicer mRNA相對水平

圖1 Dicer-siRNA的篩選(1：小siRNA334；2：siRNA1658；3：siRNA1897)

2.2 轉染Dicer siRNA1658后A2780細胞的Dicer的沉默效率 實時定量PCR結果顯示，以未轉染A2780細胞Dicer基因的mRNA表達水平為100%，siDicer-A2780細胞Dicer基因的mRNA水平為(0.157±0.012)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。siNC-A2780轉染組細胞Dicer基因的mRNA表達水平為(1.073±0.061)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明siRNA1658-Dicer能有效抑制Dicer的mRNA表達，見圖2。同時，蛋白免疫印跡實驗的結果在蛋白水平驗證了siRNA對Dicer的有效抑制。以未轉染A2780細胞Dicer基因的蛋白表達水平為100%，siDicer-A2780細胞Dicer基因的蛋白水平下降為(0.153±0.021)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而siNC-A2780轉染組細胞Dicer基因的蛋白水平是未轉染組細胞表達水平的(1.013±0.021)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

Dicer mRNA相對表達水平

圖2 轉染siRNA后各組細胞Dicer mRNA的表達(1：A2780；2：A2780-siNC；3：A2780-siDicer)Dicer蛋白表達水平

圖3 轉染小干擾RNA(siRNA)后各組細胞Dicer的蛋白表達(1：A2780；2：A2780-siNC；3：A2780-siDicer)

2.3 細胞生長情況 在種板后第3天、第4天、第5天，siDicer轉染的A2780細胞增殖能力增強，與對照組細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 Dicer-siRNA轉染對A2780細胞生長的影響

2.4 細胞增殖情況 與對照組轉染siNC的細胞相比，轉染siDicer 96 h后，siDicer-A2780細胞的增殖活性平均上升了23%，見圖5。

圖5 Dicer-siRNA轉染對A2780細胞增殖的影響

(1：A2780-siNC；2：A2780-siDicer)

2.5 細胞生長周期情況 細胞周期分析結果顯示siDicer-A2780細胞中G0/G1期細胞占(44.26±0.48)%，S期細胞占(25.05±1.2)%，G2/M期細胞占(21.53±0.77)%；對照組siNC-A2780細胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%，S期占(20.01±1.22)%，G2/M期占(19.8±0.24)%。siDicer-A2780細胞S期和G2/M細胞較對照組細胞明顯增加，而G0/G1期細胞則減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)見圖6。提示Dicer可能通過調節(jié)細胞周期的進程從而影響卵巢癌細胞的增殖能力。

圖6 Dicer-siRNA轉染對A2780細胞細胞周期的影響

2.6 Transwell遷移實驗的結果 在Transwell小室濾膜上，與對照組siNC-A2780細胞的穿膜細胞數相比，抑制Dicer表達siDicer-A2780 細胞的穿膜細胞數增加(3.99±0.29)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖7。提示Dicer沉默能增強A2780的遷移能力，Dicer表達的下調有助于促進卵巢癌疾病的進展。

(a)

(b)

3 討 論

微小RNA(miRNA)是一組保守的非編碼小RNA。近年研究表明，miRNA表達失調與多種腫瘤相關[2-6]。對多種腫瘤的研究發(fā)現存在miRNA的表達譜及其調控的生物學過程的改變[7-8]，miRNAs在腫瘤形成過程中的作用引起研究者的關注。作為miRNA調控的關鍵因子，Dicer的異常改變可能會導致miRNA的異常表達，并且和很多癌癥相關。本研究結果表明，當靶向抑制Dicer酶的siRNA抑制Dicer的表達后，卵巢癌細胞的生物學行為發(fā)生明顯變化，增殖與侵襲能力均明顯增強。結果提示，作為miRNA的關鍵調控因子，降低Dicer酶的表達可能導致成熟miRNA表達水平的降低，從而促進腫瘤的形成。近來對其他腫瘤細胞的研究也發(fā)現了類似的結果。體外實驗發(fā)現，抑制Dicer的表達可以明顯增強乳腺癌細胞的侵襲性及人源胚胎腎HEK293T細胞的遷移能力[9]。而且，在分子水平，抑制人腫瘤細胞株U251，MCF-7和SCG7901中Dicer的表達可以提高細胞周期相關分子cyclin A和PCNA及侵襲促進因子MMP-2和MMP-9的表達。活體實驗表明，皮下注射腺病毒基因沉默Dicer的乳腺癌MCF-7細胞可以促進腫瘤細胞的生長[10]。

此外，通過靶向抑制miRNA成熟過程中包括Dicer酶在內的幾個重要的酶，導致癌細胞miRNA水平顯著降低，癌細胞隨之出現進一步惡化的表型。在實驗動物體內，miRNA加工受損的細胞會加速形成腫瘤，且更具侵襲性。這些研究結果均表明Dicer酶起著一個抑癌基因的作用，降低其表達，可能全面抑制miRNAs的表達，可以導致腫瘤生物學特征的惡化，促進腫瘤的形成。

本實驗發(fā)現，靶向Dicer酶的siRNA抑制A2780細胞Dicer的表達會促進細胞周期的進程。有意思的是，研究表明，降低乳腺癌MCF-7細胞Dicer的表達會導致G1停滯并提高對鉑類藥物的敏感性，這表明Dicer調節(jié)細胞周期的作用存在腫瘤類型特異性的差異。這可能和不同腫瘤存在miRNA的表達譜差異有一定的關系，這值得研究者進一步探索。

綜上所述，我們的研究結果表明，沉默Dicer具有促進卵巢癌細胞A2780增殖和侵襲的能力，但仍需要進一步的體內試驗證實。對Dicer在卵巢癌腫瘤形成中的作用及其機制的深入研究，將為臨床治療卵巢癌提供新的治療靶點。

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Influence of RNA interference targeting Dicer on biological function of ovarian cancer cells

HEZhonghui1,LUFangfang2，XUHong1,WANGZehua3 ,CHIBo1,KUANGYan1*

(1DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；2theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；3.DepartmentofObstetricsandGynecology,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430022,China)

Objective To investigate the effect of inhibition of Dicer on the proliferation and migration of ovarian carcinoma cell A2780, thus to further specify the role of Dicer in biological behavior of ovarian cancer. Methods The synthetic Dicer small interfering(Dicer siRNA) was transfected into A2780 cells and the effective siRNA was selected. The expression of Dicer mRNA and protein were detected by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.The growth and viability of cells were measured by MTT. Cellmigration was measured by Transwell chambers.Cell cycle was detected by flow cytometry.Results The expression of Dicer mRNA in the siRNA1658 transfected group (0.194±0.002)was the lowest compared with the non-transfected group, and was significantly lower than that in the siRNA1897 group(0.535±0.015), (P<0.001).But there was no statistical difference in the expression of Dicer mRNA between the siRNA1658 transfected group and the siRNA334 group(0.251±0.014) (P>0.05).The result of real-time quantitative PCR showed that the Dicer mRNA level of siDicer-A2780 cell relatively decreased (0.157±0.012) when the Dicer mRNA level of non-transfected A2780 cell was defined as 100%(P<0.001). Dicer protein level of siDicer-A2780 cell relatively decreased (0.153±0.021)when the Dicer protein level of non-transfected A2780 cell was defined as 100%(P<0.001). At the 3rd, 4th and 5th days,the proliferation of A2780 cells transfected by siDicer increased compared with the cells in the control group(allP<0.05). After 96 hours of transfection by siDicer, the proliferation activity of siDicer-A2780 cells increased by an average of 23% compared with the cells transfected by siNC in the control group.The result of cell cycle analysis showed that siDicer-A2780 cells at theG0/G1 phase, S phase and G2/M phase accounted for (44.26±0.48)%，(25.05±1.20)% and (21.53±0.77)% respectively. In the control group, siNC-A2780 cells at G0/G1 phase, S phase and G2/M phase accounted for (52.79±1.11)%，(20.01±1.22)% and (19.80±0.24)% respectively. The numbers of siDicer-A2780 cells at S phase and G2/M phase were more， but the number of cells at G0/G1 phase was less compared with the cells of the control group(P<0.001). Dicer-inhibited siDicer-A2780 cells penetrating membrane achieved (3.99±0.29)folds increase in the number compared to siNC-A2780 cells in the control group(P<0.001). Conclusion Dicer gene obtains the ability of inhibiting growth and invasion of ovarian cancer cells.

Ovarian cancer； Dicer gene；Cell proliferation；Cell invasion ；Therapy target

廣西高?？茖W技術研究項目(編號：YB2014058 )，廣西碩士研究生科研創(chuàng)新課題(編號：YCSZ2014101)

R 737.31

A

1673-6575(2017)04-0459-06

10.11864/j.issn.1673.2017.04.03

2017-04-23

2017-06-18)

*通信作者