自噬相關(guān)蛋白LC3A與Ki67在胃腺癌中的表達(dá)①

邱瑞蘋(píng)，王彩霞

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

自噬相關(guān)蛋白LC3A與Ki67在胃腺癌中的表達(dá)①

邱瑞蘋(píng)，王彩霞

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討自噬相關(guān)蛋白LC3A在胃腺癌組織中的表達(dá)及其與Ki67的關(guān)系。方法：采用免疫組化Elivision方法檢測(cè)55例胃腺癌組織及25例正常癌旁組織LC3A和Ki67的表達(dá)情況。結(jié)果：(1)LC3A在胃腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2)在胃腺癌組織中LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)(“stone-like”structure，SLS)與胃癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Ki67的表達(dá)呈正相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論：胃腺癌組織“石頭樣”結(jié)構(gòu)的高表達(dá)提示胃癌預(yù)后不良，LC3A聯(lián)合Ki67的檢測(cè)有助于胃腺癌的進(jìn)展和預(yù)后的評(píng)估。

自噬；胃癌；LC3A

胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的數(shù)據(jù)，在2012年有951600例新發(fā)胃癌病例，其中有723100例死于胃癌[1]，采取合適的治療手段提高患者的生存質(zhì)量是成為目前的熱點(diǎn)[2]。以往研究表明，腫瘤的發(fā)生是正常細(xì)胞基因突變后無(wú)限增殖與抗凋亡所致,近年來(lái)，一種與凋亡相似的生物現(xiàn)象—自噬引起人們的關(guān)注[3]。自噬(Autophagy)是指胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器被運(yùn)送到溶酶體中被大量降解的生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞自噬的發(fā)生以胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體(autophagosomes)為主要特征，它是一種雙層膜結(jié)構(gòu)、由胞質(zhì)成分構(gòu)成的細(xì)胞器，通過(guò)與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體來(lái)降解大分子物質(zhì)[4]。通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，一方面使大分子物質(zhì)和細(xì)胞器降解為氨基酸、核苷酸及游離脂肪酸，并被重新利用以合成新的大分子物質(zhì)，另一方面，可以減少異常蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器的堆積，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬在人類(lèi)多種疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)退行性疾病、感染、心血管疾病、肺部疾病和人類(lèi)老化等，在腫瘤方面的研究是近年來(lái)的熱點(diǎn)。自噬的發(fā)生過(guò)程總是伴隨著自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related gene，ATG)的調(diào)控。迄今為止已發(fā)現(xiàn)36種，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtuble associated protein light chain 3，MAPLC3)簡(jiǎn)稱 LC3，是哺乳動(dòng)物ATG8的同源物，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬體標(biāo)記蛋白,定位于自噬體膜上，其含量的多少與自噬泡的數(shù)量正相關(guān)，LC3有三種亞型，即LC3A、LC3B、LC3C。臨床上經(jīng)常運(yùn)用Ki67作為胃癌惡性程度及評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)胃癌中LC3A和Ki67的表達(dá)，探討其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為胃癌的診斷、治療及預(yù)后提供客觀的參考指標(biāo)，同時(shí)為胃腺癌分子靶向治療藥物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫組化石蠟標(biāo)本:收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2014-01～2016-04經(jīng)手術(shù)切除的胃腺癌患者的組織蠟塊和HE切片。其中胃腺癌組織55例，癌旁正常組織25例。所有研究對(duì)象術(shù)前均未接受任何輔助治療，其中男40例，女15例，年齡35～79歲，術(shù)后病理證實(shí)高-中分化腺癌33例，低分化腺癌22例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，有血管侵犯者29例，無(wú)血管侵犯者26例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者17例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者38例。

1.1.2 試劑:兔抗人單克隆抗體LC3A(稀釋比：1:200)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，兔抗人單克隆抗體即用型Ki67、通用型二抗、DAB顯色液均購(gòu)自福州邁新公司。采用已知LC3A陽(yáng)性表達(dá)的腦組織作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2 方法

免疫組化Elivision法：將石蠟脫蠟、水化、自來(lái)水沖洗后，進(jìn)行檸檬酸熱修復(fù)(pH6.0、熱修復(fù)2min)，滴加一抗(LC3A、Ki67)，37℃孵育3h，PBS沖洗后滴加放大劑(試劑A)，常溫孵育20minPBS沖洗后滴加多聚酶結(jié)合物(試劑B)，PBS沖洗后DAB顯色(LC3A、Ki67顯色時(shí)間為2～3min),經(jīng)過(guò)蘇木素復(fù)染、分化返藍(lán)、透明后封片。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 LC3A的判讀

彌漫性的胞漿表達(dá)為定位于胞漿內(nèi)彌漫的棕黃色顆粒樣著色，采用半定量積分法[4]，即陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例：小于10%為0分，10%～50%為1分，大于50%為2分，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分，兩者相乘，0～3分為低表達(dá)，4～6分為高表達(dá)；石頭樣表達(dá)：主要表現(xiàn)為胞漿內(nèi)球形深褐色的暈染結(jié)構(gòu)，隨機(jī)選取十個(gè)400倍腫瘤視野計(jì)算總的“石頭樣”結(jié)構(gòu)的個(gè)數(shù),取中位數(shù)(median value)為截?cái)嘀礫5]，高于中位數(shù)(包括中位數(shù))的為高表達(dá)，低于中位數(shù)的為低表達(dá)。

1.3.2 Ki67的判讀:Ki67定位于細(xì)胞核棕黃色的表達(dá)，采用半定量積分法判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件, 不同分組間蛋白的表達(dá)差異及各蛋白與臨床病理因素之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC3A在胃癌組織中LC3A有兩種表達(dá)方式，即彌漫性胞漿表達(dá)(diffuse cytoplasmic)，見(jiàn)圖1、圖2、石頭樣表達(dá)(“stone-like”structure，SLS)，而在癌旁正常組織(見(jiàn)圖1)中只有少量彌漫性胞漿表達(dá)，在胃癌組織中，彌漫性胞漿表達(dá)方式陽(yáng)性率為80%(20/25)，明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(陽(yáng)性率為36%)，見(jiàn)表1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 癌旁正常組織LC3A的表達(dá) (Elivision法×200)(左上方為正常組織、 右下方為胃癌組織)

圖2 胃癌組織LC3A彌漫性胞漿表達(dá) (Elivision法×200)表1 胃癌組織與癌旁組織LC3A彌漫性胞漿表達(dá)方式的比較

高低高表達(dá)率(%)χ2值P胃癌組織20580癌旁組織916369.9<0.05

2.2 “石頭樣”結(jié)構(gòu)僅見(jiàn)于胃癌組織內(nèi)，見(jiàn)圖3,經(jīng)分析后得出，每個(gè)400倍視野“石頭樣”結(jié)構(gòu)范圍為0～11個(gè)，中位數(shù)為5，胃癌組織中“石頭樣”結(jié)構(gòu)高表達(dá)率為70%(39/55)，與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67的表達(dá)，見(jiàn)圖4，呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3 彌漫性胞漿表達(dá)(高表達(dá)率為80%)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、血管侵犯及Ki67的表達(dá)等無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

圖3 胃癌組織LC3A石頭樣結(jié)構(gòu)(箭頭所示) (Elivision法×400)

圖4 胃癌組織Ki67胞核陽(yáng)性表達(dá) (Elivision法×200)表2 胃癌組織不同表達(dá)方式與臨床病理之間的關(guān)系

石頭樣結(jié)構(gòu)高低χ2值P彌漫性胞漿表達(dá)高低χ2值P分化程度 高-中分化249276 低分化1570.132>0.051750.17>0.05浸潤(rùn)深度 T1～T3910154 T43067.79<0.052970.02>0.05淋巴結(jié)侵犯 陽(yáng)性327336 陰性798.06<0.051151.78>0.05血管侵犯 陽(yáng)性218263 陰性1880.06>0.051883.57>0.05遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 有152134 無(wú)24144.19<0.053170.19>0.05Ki67 高296269 低10109.32<0.051821.92>0.05性別 男2614346 女1322.48>0.051052.29>0.05年齡(歲) >60289316 ≤601171.25>0.051351.01>0.05

2.4 在胃癌組織中，高表達(dá)的石頭樣結(jié)構(gòu)伴隨著高表達(dá)的彌漫性胞漿表達(dá)，見(jiàn)表3，可能提示彌漫性胞漿表達(dá)反應(yīng)自噬的基礎(chǔ)水平。

表3 LC3A在胃癌組織中不同表達(dá)方式的關(guān)系

3 討論

自噬通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)病原體，限制炎癥反應(yīng)及自噬性細(xì)胞死亡等方式抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，自噬通過(guò)為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抑制凋亡作用、降低腫瘤細(xì)胞的敏感性、幫助癌細(xì)胞度過(guò)休眠期等方式促進(jìn)癌組織的發(fā)展。綜上，自噬在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起著雙刃劍的作用。大量文獻(xiàn)報(bào)道，LC3A在大部分惡性腫瘤中是高表達(dá)的，如卵巢癌、肝細(xì)胞性肝癌、皮膚鱗癌[6]、非小細(xì)胞型肺癌[7]和尿路上皮癌等，在我們的研究中，與癌旁組織(9/25)相比，胃癌組織LC3A表達(dá)(39/55)在是明顯升高的，表明自噬水平在惡性腫瘤中是升高的；在本實(shí)驗(yàn)中，胃癌組織存在兩種表達(dá)方式，即彌漫性胞漿表達(dá)和“石頭樣”表達(dá)，但是彌漫性胞漿表達(dá)這種方式與臨床病理參數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，且石頭樣結(jié)構(gòu)的高表達(dá)與彌漫性的胞漿表達(dá)正相關(guān)，這些研究結(jié)果可能提示LC3A彌漫性胞漿表達(dá)反映了癌細(xì)胞基礎(chǔ)的自噬水平。

我們的研究表明，“石頭樣”結(jié)構(gòu)只表達(dá)在胃癌細(xì)胞中且與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Ki67的表達(dá)呈正相關(guān)，提示預(yù)后不良，在55例胃腺癌組織中，高表達(dá)的石頭樣結(jié)構(gòu)有39例，高表達(dá)率為70%，在17例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例中有15例LC3A“石頭樣結(jié)構(gòu)”高表達(dá)，腫瘤惡性程度越高，LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的頻率越高，腫瘤細(xì)胞增殖活性相應(yīng)的越高。在其他惡性腫瘤中也可以看見(jiàn)相似的現(xiàn)象，例如，在肝細(xì)胞性肝癌中，“石頭樣”結(jié)構(gòu)數(shù)目與血清AFP、分化程度、血管侵犯等正相關(guān)，在前列腺癌中，“石頭樣”結(jié)構(gòu)與Gleason評(píng)分正相關(guān)，綜上表明高表達(dá)“石頭樣”的癌細(xì)胞代表了更高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞。

傳統(tǒng)手術(shù)切除是胃癌根本的治療方法，但是由于胃癌早期臨床癥狀不明顯，所以大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已到中晚期，腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的獲得性耐藥是癌癥治療的主要障礙，自噬可能在惡性腫瘤細(xì)胞的治療抵抗上扮演著重要的角色。已有研究證明，5-FU(5-氟尿嘧啶)可以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，也能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，這種自噬可以對(duì)抗腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，在結(jié)腸癌細(xì)胞中運(yùn)用自噬抑制劑3-MA(三甲基腺嘌呤)后，細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)[8]，運(yùn)用自噬調(diào)節(jié)劑可能是癌癥靶向治療的新思路，而什么樣病人運(yùn)用自噬調(diào)節(jié)劑可以對(duì)臨床治療有幫助呢？在胃癌患者中，LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)的高表達(dá)可能提示這類(lèi)患者運(yùn)用自噬抑制劑會(huì)有好的臨床效果。對(duì)自噬水平明顯升高的患者運(yùn)用自噬阻斷劑可能為胃癌的治療指出新思路。

綜上所述，LC3A“石頭樣”結(jié)構(gòu)可能是監(jiān)測(cè)胃癌預(yù)后理想的指標(biāo)，高表達(dá)的“石頭樣”結(jié)構(gòu)預(yù)后差，腫瘤侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，在以后的研究中，聯(lián)合檢測(cè)ATG5、ATG9、ATG12等自噬相關(guān)蛋白，運(yùn)用多種方法檢測(cè)可能更好的了解自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用。

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Highlights: Objective: Purpose To investigate the expression of autophagy-related gene LC3A in gastric carcinoma tissue and the relationship with Ki-67. Methods: Immunohistochemical method was used to determine the expression of LC3A and Ki67 in 85 cases of gastric adenocarcinoma tissue and 45 cases of normal tissue adjacent to carcinoma. Results：The expression of LC3A was significantly higher in gastric adenocarcinoma than normal tissue adjacent to carcinoma(P<0.05); Stone-like”structure (SLS) counts were closely associated with lymph node metastasis, depth of tumor invasion, metastases distant, and were positively related to the expression of Ki67(P<0.05). Conclusion: The increased number of SLS in gastric carcinoma was related to poor prognosis; it was useful to evaluate the development and the prognosis of the gastric adenocarcinoma by detecting the expression of LC3A and Ki67.

The expression and significance of sutophagy related gene LC3A and Ki67 in gastric adenocarcinoma

QIURui-ping，WANGCai-xia

(Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

autophagy;gastric carcinoma;LC3A

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號(hào)：12541825。

邱瑞蘋(píng)(1988～)女，山西大同人， 在讀碩士研究生。

王彩霞(1966～)女，黑龍江綏化人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。 E-mail：wcx19641027@163.com。

R735.2

B

1008-0104(2017)04-0008-03

2016-12-01)