隔藥餅灸對(duì)功能性消化不良肝郁脾虛模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的影響※

康樂 薔薇 葉意紅 劉秋佳 劉未艾

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸-腦病科，湖南長(zhǎng)沙410005）

隔藥餅灸對(duì)功能性消化不良肝郁脾虛模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的影響※

康樂 薔薇1葉意紅1劉秋佳1劉未艾2*

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸-腦病科，湖南長(zhǎng)沙410005）

目的觀察隔藥餅灸對(duì)功能性消化不良（Functional Dyspepsia，F(xiàn)D）肝郁脾虛型模型大鼠血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，探討隔藥餅灸治療FD的另一可能作用機(jī)制。方法將50只SD大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾炷灸組、逍遙散組每組各10只，空白組正常飼養(yǎng)，其余4組均采用復(fù)合病因法(慢性束縛應(yīng)激+過度疲勞+飲食失節(jié)+夾尾+搖晃)進(jìn)行造模，造模21 d后按被試因素分組治療14d，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α的含量。結(jié)果與空白組比較，模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α含量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，隔藥餅灸組、艾炷灸組、逍遙散組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降(P＜0.01)，且隔藥餅灸組效果優(yōu)于艾炷灸組、逍遙散組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與艾炷灸組比較，隔藥餅灸組、逍遙散組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論隔藥餅灸可能是通過下調(diào)促炎因子，糾正IL-6、IL-1β及TNF-α的失衡，促進(jìn)胃腸動(dòng)力恢復(fù)，從而達(dá)到治療該病的目的。

隔藥餅灸；功能性消化不良；肝郁脾虛模型；IL-6；IL-1β；TNF-α；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

功能性消化不良是一種非器質(zhì)性疾病，在消化系統(tǒng)中比較常見，其主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作性上腹疼痛或不適感，伴有噯氣、腹脹、早飽、惡心或嘔吐等癥狀。FD的患病率在不同的人群中表現(xiàn)不同，流行病學(xué)調(diào)查表明，歐美國(guó)家患病率在20%～25%，亞洲國(guó)家發(fā)病率約為8%～25%[1-2]。我國(guó)FD的患病率總體偏高，國(guó)內(nèi)Yan-Qing Li對(duì)5000名在校大學(xué)生的問卷調(diào)查研究顯示FD的患病率為9.25%，其中女性患病率高于男性[3]。至今為止，關(guān)于FD的病因及發(fā)病機(jī)制還沒有完全明確，有研究表明[4-5]FD的發(fā)病與內(nèi)臟高敏感性、胃腸動(dòng)力障礙、外周血免疫激活、炎癥及心理因素等有關(guān)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在人體免疫防御系統(tǒng)中，胃腸道黏膜以及黏膜中相關(guān)淋巴組織、胃腸分泌和運(yùn)動(dòng)功能的完整、位于胃腸道的炎癥免疫細(xì)胞和一些細(xì)胞因子，發(fā)揮著局部免疫防御與監(jiān)視作用，在自身免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮不可或缺的作用[6-7]。我們課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸能改善肝郁脾虛模型大鼠的胃腸動(dòng)力，表明隔藥餅灸對(duì)功能性胃腸病有良好的治療效果[8-9]。本實(shí)驗(yàn)旨在前期研究的基礎(chǔ)上，通過觀察隔藥餅灸對(duì)FD肝郁脾虛型大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量的影響，進(jìn)一步探討隔藥餅灸治療肝郁脾虛型FD可能的作用機(jī)制，為隔藥餅灸治療FD提供更客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的50只SPF級(jí)SD大鼠(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004)，雌雄各半，月齡約3個(gè)月，體重約220g。飼養(yǎng)溫度25℃，濕度50%～70%。

1.2 藥物及主要實(shí)驗(yàn)器材、試劑逍遙散中藥飲片(購自湖南省中醫(yī)院中藥房)；太極灸(出口型)；自制的簡(jiǎn)易艾灸底座；ELISA試劑盒(長(zhǎng)沙維世爾生物科技有限公司)；BCD-245F普通冰箱(榮事達(dá))；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湘儀，TGL-16)；酶標(biāo)儀(匯松，MB-530)；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)(匯松，PW-812)；恒溫振蕩器(強(qiáng)樂，THZC)。

1.3 研究方法

1.3.1 動(dòng)物分組將SD健康大鼠50只(SPF級(jí))編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為空白組和模型組，其中空白組10只(雌雄各半)，造模結(jié)束后，取造模成功的大鼠40只再按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、隔藥餅灸組、艾炷灸組和逍遙散組4組，每組10只(雌雄各半)。

1.3.2 造模及給藥參照岳利峰等[10]采用復(fù)合病因法造模，用慢性束縛應(yīng)激+過度疲勞+飲食失節(jié)的方法，束縛同時(shí)夾尾30 min、搖晃5 min。實(shí)驗(yàn)前將所有大鼠進(jìn)行預(yù)游泳，剔除游泳時(shí)間小于10 min、大于20 min的大鼠，預(yù)游泳合格的造模大鼠每天早晨8:00置于束縛盒中束縛3 h，同時(shí)夾尾30 min、搖晃5 min，下午14:00置于盛有溫水的大塑料桶中游泳10 min（水溫約22℃左右）。隔日足量給食，隔日禁食，連續(xù)21 d?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不做任何處理；模型組造模后每日行捆綁束縛30 min，并灌服0.9%氯化鈉注射液，灌胃容積均為1 ml/100 g體質(zhì)量(下同)；隔藥餅灸組造模后行隔藥餅灸30 min，并灌服0.9%氯化鈉注射液；艾炷灸組造模后行艾炷灸30 min，并灌服0.9%氯化鈉注射液；逍遙散組造模后行捆綁束縛30 min，灌服逍遙散水煎劑1 ml/100 g，共14 d。

1.3.3 施灸方法(1)選穴：I組：肝俞、脾俞、胃俞；II組：章門、期門、中脘（均為雙側(cè)）。取穴定位參照新世紀(jì)全國(guó)高等中醫(yī)院校規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]及華興邦的大鼠穴位圖譜[12]。

(2)隔藥餅灸法：隔藥餅灸的艾炷選用韓國(guó)出口“太極灸”艾炷，隔藥餅的藥物組成及藥餅制作：取柴胡、茯苓、白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)六味藥按等比例劑量研為粉末，并加入促透劑（冰片、氮酮）用醋調(diào)成糊狀，通過自制的艾灸底座模具捏壓成厚約2 mm、直徑為1 cm±0.1 cm的藥餅。每日8:00將大鼠捆綁束縛于鼠板上，取穴定位剪毛后用細(xì)繩將放置好藥餅的艾灸底座固定在穴位上，然后將直徑為0.5 cm±0.2 cm，高度為0.8 cm±0.1 cm的艾炷穿過自制模具的鐵纖放在藥餅上，點(diǎn)燃施灸，待艾炷燃完且余熱散盡后，再換另一壯，每穴連續(xù)灸4～5壯(約30 min)，1次/d，I、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，連續(xù)治療14 d。艾炷灸法：于造模后的第1天同時(shí)施加灸法治療，將大鼠捆綁束縛于鼠板上，取穴定位剪毛后，將直徑為0.5±0.2 cm的太極灸艾炷粘在穴位上，點(diǎn)燃施灸，待艾炷燃完且余熱散盡后，再換另一壯，艾灸時(shí)間、次數(shù)、取穴及療程同隔藥餅灸組。

1.3.4 逍遙散水煎劑制備柴胡∶當(dāng)歸∶白芍∶白術(shù)∶茯苓∶甘草∶薄荷∶煨姜根據(jù)2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1的比例進(jìn)行配方。先將以上藥物(薄荷除外)用蒸餾水浸泡1 h，后用武火煎至沸騰，再以文火煎煮2 h，薄荷于起鍋前10 min放入，藥汁用紗布過濾；藥渣再加入蒸餾水用文火煎煮1 h后過濾取藥汁。兩次藥汁合并，再將藥汁濃縮至含生藥2 g/ml，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 指標(biāo)觀察和檢測(cè)方法IL-6、IL-1β及TNF-α的取材：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，用20%烏拉坦4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，予腹主動(dòng)脈采血，常溫放置2 h，4℃3000 rpm，離心15 min，取上清液，-20℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的水平，操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理。全部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用（x±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。滿足正態(tài)性和方差齊性者，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)性和方差齊性者，多組計(jì)量資料比較采Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

由表1可見，與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，隔藥餅灸組、艾炷灸組、逍遙散組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降(P＜0.01)，且隔藥餅灸組效果優(yōu)于艾炷灸組及逍遙散組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與艾炷灸組比較，隔藥餅灸組、逍遙散組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明隔藥餅灸組、艾炷灸組及逍遙散組能明顯降低FD肝郁脾虛模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的含量，而隔藥餅灸組的療效更優(yōu)于艾炷灸組及逍遙散組。

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α的比較(pg/ml，x±s，n=10)

3 討論

FD是臨床常見的一種非器質(zhì)性消化系統(tǒng)疾病，F(xiàn)D的臨床癥狀可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為上腹脹滿、噯氣、餐后飽脹、食欲不振、腹痛、腹瀉等。中醫(yī)認(rèn)為本病病位在胃，與肝脾二臟關(guān)系甚密?！夺t(yī)方考》言：“瀉責(zé)之脾，痛責(zé)之肝，肝責(zé)之實(shí)，脾責(zé)之虛，脾虛肝實(shí)，故令痛瀉”?！端氖バ脑础吩唬骸澳疽园l(fā)達(dá)為性，己土濕陷，抑遏乙木發(fā)達(dá)之氣，生意不遂，故郁怒而克脾土，風(fēng)動(dòng)而生疏泄，凡腹痛下利，皆風(fēng)木之疏泄也”?？梢姼文疽哉{(diào)達(dá)為暢，肝氣郁結(jié)，失于疏泄，橫逆犯脾胃，脾胃升清降濁功能失調(diào)，運(yùn)化水濕失司，導(dǎo)致泄瀉，故肝郁脾虛，肝旺乘脾，升降失常，為病機(jī)之關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)采用慢性束縛應(yīng)激+過度疲勞+飲食失節(jié)的造模方法來建立肝郁脾虛模型大鼠，束縛應(yīng)激可使大鼠產(chǎn)生煩躁欲怒的情志，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，失于疏泄條達(dá)。過度疲勞及飲食失節(jié)致大鼠脾胃虛弱，生理功能紊亂，而出現(xiàn)胃腸功能減退。選用隔藥餅灸做為本病的治療方法，藥餅的藥物組成以逍遙散為主，有研究表明逍遙散能夠改善慢性應(yīng)激大鼠的便稀、攝食量減少以及體重過低等癥狀[13]，并能增強(qiáng)胃腸內(nèi)容物的推進(jìn)功能[14]。方中柴胡疏肝解郁，使肝氣得以條達(dá)，木不達(dá)致脾虛不運(yùn)，以茯苓、白術(shù)、陳皮健脾益氣，白芍養(yǎng)血柔肝，防風(fēng)散肝舒脾，六藥合用，使肝郁得疏，脾弱得復(fù)。在選穴上采用俞募配穴法，取肝之背俞穴肝俞、募穴期門以疏肝理氣解郁，調(diào)暢肝經(jīng)氣機(jī)而止痛止瀉；胃之背俞穴胃俞、募穴中脘調(diào)理脾胃；脾之背俞穴脾俞、募穴章門以益氣健脾和胃，升清降濁；諸穴合用，以達(dá)疏肝和胃、理氣解郁、益氣健脾之效。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子在胃腸動(dòng)力方面發(fā)揮著重要作用，有些胃腸動(dòng)力疾病的組織學(xué)改變是以胃腸道的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)為主，免疫細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)可介導(dǎo)胃腸動(dòng)力改變[15]。IL-6作為炎性因子與胃腸道炎性反應(yīng)存在一定的關(guān)聯(lián)性[16]。Maruna等[17]用胃電圖分別檢測(cè)開腹膽囊切除術(shù)和腹腔鏡下膽囊切除術(shù)的患者，發(fā)現(xiàn)胃腸動(dòng)力障礙與全身炎癥反應(yīng)相關(guān)。進(jìn)一步的研究顯示IL-6的濃度與胃腸功能障礙的程度呈正相關(guān)，隨著IL-6濃度的下降，胃腸動(dòng)力則逐漸恢復(fù)。IL-1β既是促炎因子，也是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可刺激各種炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)及炎癥蛋白的釋放，對(duì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有趨化作用，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[18]。研究表明[19]IL-1β能夠抑制腸Na-K-ATP酶的活性，進(jìn)而抑制水、鈉吸收而引起腹瀉，最終導(dǎo)致胃腸功能的紊亂。TNF-α是在炎癥過程起重要作用的炎癥因子，通過提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力、促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)。Papadakis等[20]研究表明，低濃度的TNF-α在腸黏膜內(nèi)通過自分泌或旁分泌方式在局部發(fā)揮作用，誘發(fā)腸黏膜炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)D肝郁脾虛模型大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均顯著升高，中醫(yī)肝郁脾虛相當(dāng)于現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)所說的緊張、焦慮、抑郁等精神狀態(tài)，這些不良情緒可以導(dǎo)致FD的發(fā)生，這兩者之間相互影響。有研究表明FD患者血清IL-6水平顯著高于正常健康受試者，且與焦慮、抑郁評(píng)分呈正相關(guān)[16]。IL-1β、TNF-α可刺激各種炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致胃腸功能的紊亂[19-20]。經(jīng)隔藥餅灸治療后，F(xiàn)D模型組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α均顯著下降，F(xiàn)D大鼠癥狀得到明顯改善，逍遙散能明顯減低IL-6、IL-1β及TNF-α等炎癥因子的水平[21]。并且隔藥餅灸具有集藥物效應(yīng)、溫?zé)嵝?yīng)及穴位刺激效應(yīng)于一體的作用，三者合一，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，降低炎癥反應(yīng)，改善胃腸功能障礙，達(dá)到治療FD的目的。這一結(jié)果表明，F(xiàn)D的發(fā)生可能與IL-6、IL-1β及TNF-α水平改變存在某些關(guān)聯(lián)，推測(cè)炎癥反應(yīng)激活自身免疫在FD的發(fā)生中起一定的作用，并與IL-6、IL-1β及TNF-α刺激胃腸道神經(jīng)元，使機(jī)體產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃腸功能障礙有關(guān)。IL-6、IL-1β及TNF-α可能成為FD病情評(píng)估的指標(biāo)之一。這對(duì)FD的認(rèn)識(shí)提供了新視角，為臨床治療FD提供了新思路。

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Effect of Herbal Cake-separated Moxibustion on the Expression of Interleukin-6 Interleukin-1β and Tumor Necrosis Factor-α of Functional Dyspepsia Rats

KANG Leqiangwei1,YE Yihong1,LIU Qiujia1,LIU Weiai2
(1.Hunan University Of Chinese Medicine，Changsha，Hunan Province，410000；
(1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Hunan Province,Changsha 410005,China; 2.Department of Acupuncture-Encephalopathy,the Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Hunan Province, Changsha 410005,China)

Objective To observe the effect of cake-separated moxibustion on interleukin-6,interleukin-1β and tumor necrosis factor-α of functional dyspepsia(FD)rats,and to explore the herbal cake-separated-moxibustion another possible mechanism for treatment of FD.Methods According to random number table method,50 SD rats were randomly divided into blank group,model group,herbal cake-separated moxibustion group,moxa-cone moxibustion group and Xiaoyao powder group,and each group had 10 rats.The blank group

normal feeding,the the rest of the four groups underwent modeling by applying chronic restraint stress,excessive fatigue,irregularfood,clip tail,shaking for 21 consecutive days.Then each group underwent treatment respectively for 14 days.At the end of the experiment,the contents of IL-6,IL-1β and TNF-α in rats serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay method.Results As compared with blank group,the serum levels of IL-6,IL-1β and TNF-α in the model rats were increased,there had significant differences(P＜0.01).Comparing with the model group,the serum levels of IL-6,IL-1β and TNF-α were decreased in herbal cake-separated moxibustion group,moxa-cone moxibustion group and Xiaoyao powder group(P＜0.01),and herbal cakeseparated moxibustion group was better than moxa-cone moxibustion group and Xiaoyao powder group,and there had significant differences(P＜0.01).Comparing with tomoxa-cone moxibustion group,the serum levels of IL-6,IL-1β and TNF-α were decreased in herbal cake-separated moxibustion group and Xiaoyao powder group(P＜0.01),and there were significant differences(P＜0.01). Conclusion The cake-separated moxibustion may be via to down regulation of proinflammatory factors and correct the imbalance of IL-6,IL-1β and TNF-α,promote the recovery of gastrointestinal motility,so as to achieve the purpose of treatment of the disease.

cake-separated moxibustion;functional dyspepsia;liver stagnation and spleen deficiency model;IL-6;IL-1β;TNF-α; animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.060

1672-2779（2017）-16-0137-04

：李海燕本文校對(duì)：付磊

2017-07-10）

國(guó)家自然科學(xué)基金【No.81173326，81303049】；湖南省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目【No.2013117，No.2015134】

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