糖腎降濁顆粒對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織AGEs和轉(zhuǎn)移因子β1的影響及作用機(jī)制探討

徐孝旺，徐孝興

(1.唐山市古冶區(qū)中醫(yī)院，河北 唐山 063101；2.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063100)

糖腎降濁顆粒對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織AGEs和轉(zhuǎn)移因子β1的影響及作用機(jī)制探討

徐孝旺1，徐孝興2

(1.唐山市古冶區(qū)中醫(yī)院，河北 唐山 063101；2.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063100)

目的：探討糖腎降濁顆粒對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織糖基化終產(chǎn)物(AGEs)及轉(zhuǎn)移因子β1的影響，探討其治療糖尿病腎病的作用機(jī)制。方法：采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備糖尿病腎病大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥組，給藥8周后采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠腎組織中AGEs及TGF-β1的水平，比較血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿蛋白(Pro)水平及腎組織C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。結(jié)果：中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組大鼠BUN、SCr和Pro水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：糖腎降濁顆粒能夠減少糖尿病腎病模型大鼠AGEs及TGF-β1表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，延緩腎臟損傷。

糖腎降濁顆粒；AGEs；TGF-β1；早期糖尿病腎??；炎癥因子

糖尿病腎病發(fā)生與長(zhǎng)期高糖狀態(tài)導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)而形成不可逆的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glyclation end-products,AGEs)引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)轉(zhuǎn)移因子β1的合成有直接促進(jìn)作用，是糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)發(fā)病機(jī)制中最主要因素[1-3]。轉(zhuǎn)移因子β1具有腎臟結(jié)構(gòu)改變，加速腎臟纖維化作用[4-5]。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)糖腎降濁顆粒對(duì)糖尿病腎病模型大鼠腎臟AGEs和TGF-β1、腎功能指標(biāo)和炎癥因子的影響，探討糖腎降濁顆粒對(duì)糖尿病腎臟大鼠的腎臟保護(hù)作用及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 藥物

糖腎降濁顆粒組成：黃芪15 g，酒大黃10 g，丹參15 g，茵陳10 g，赤芍10 g，知母15 g，黃連10 g，干姜10 g，水蛭粉3 g;免煎顆粒(天津紅日康仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)14021821)。貝那普利片(10 mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號(hào)20140518)。

1.2 試劑與儀器

注射鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；免疫組化用兔抗大鼠AGEs受體試劑盒(北京奧博生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1(BA0290，武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；CRP、IL-6和TGF-β1試劑盒(南京建成生物科技公司)；OLYMPUSAU5400全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯有限公司)；ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型建立及分組

1.3.1 模型建立

40只大鼠，體質(zhì)量(200g±20)g,采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合大鼠尾靜脈一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)42 mg/kg的造模方法[6]。高脂飼料配方：2.5%膽固醇，10%豬油脂，20%蔗糖，1%膽酸鹽，5%蛋黃粉，61.5%基礎(chǔ)飼料。喂養(yǎng)8周，分別于4、8周用代謝籠收集24 h尿液，測(cè)24 h尿蛋白定量。4周后成功制備動(dòng)物模型，導(dǎo)致微量白蛋白尿的出現(xiàn)。注射STZ后72 h，測(cè)定空腹血糖≥16.7 mmol/L,為糖尿病造模成功。4周后再測(cè)尿微量白蛋白，24h尿蛋白定量≥30 mg判定為DN大鼠造模成功。造模成功共30只大鼠。

1.3.2 分組和給藥

4周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只糖尿病腎病模型大鼠隨機(jī)分為3組，模型組10只，西藥組10只，中藥組10只。模型組給予生理鹽水灌胃，中藥組按照正常成人劑量(g/kg)的6.3倍灌胃給藥。西藥組給予貝那普利灌胃，給藥量按照正常成人給藥量等效量換算成年大鼠給藥量，即0.9 mg/(kg·d)，灌胃劑量均為5 ml/kg。連續(xù)給藥8周，每日1次。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

大鼠的腎組織經(jīng)甲醛固定，石蠟切片，進(jìn)行AGEs、TGF-β1免疫組化檢測(cè)。采用免疫組織化學(xué)染色法(SABC法)檢測(cè)腎組織中的AGEs、TGF-β1。顯色結(jié)果以高清晰度彩色分析系統(tǒng)分析，在400×高倍鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)視野，計(jì)算平均光密度值。

大鼠眶下靜脈取血2 ml，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血尿素氮(BUN)、肌酐(SC)、尿蛋白(Pro)等腎功能指標(biāo)水平。

取腎組織約100 mg，PBS 緩沖液漂洗，除去血液，稱重。加入10倍的PBS緩沖液研碎腎組織，制備腎組織勻漿。腎組織勻漿3 000 r/min離心15 min，取上清，-80℃保存待用。采用Elisa法檢測(cè)腎組織 C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠AGEs和 TGF-β1表達(dá)情況比較

中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠AGEs和 TGF-β1表達(dá)比較(平均光密度值

注：與模型組比較，aP<0.05;與西藥組比較，bP>0.05。

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)情況比較

中藥組大鼠經(jīng)中藥治療后BUN、SCr和Pro水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組BUN、SCr和Pro水平與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠BUN、SCr和Pro情況比較

注：與模型組比較，aP<0.05;與西藥組比較，bP>0.05。

2.3 各組大鼠炎癥因子比較

中藥組大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠炎癥因子含量比較

注：與模型組比較，aP<0.05;與西藥組比較,bP>0.05。

3 討論

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“虛勞”“水腫”等范疇，早期糖尿病腎病明顯的證候是“瘀證”。糖尿病腎病的主要病機(jī)是以脾腎氣陰兩虛為本，以血瘀阻滯為標(biāo)，病變部位在絡(luò)脈，血瘀為直接因素[7-12]。炎癥參與糖尿病腎病發(fā)病，CRP、IL-6等炎癥標(biāo)志物升高，代謝紊亂與血流動(dòng)力學(xué)異常是炎癥持續(xù)進(jìn)展關(guān)鍵因素[13]。本研究通過(guò)腎組織中AGEs、TGF-β1表達(dá)情況,腎功能BUN、SCr、Pro水平和CRP、IL-6和TNF-α含量的對(duì)比研究，旨在探討糖腎降濁顆粒治療糖尿病腎病大鼠的作用機(jī)制。

TGF-β1是纖維化的中心環(huán)節(jié)，參與成纖維細(xì)胞的活化、增生和表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)增多的過(guò)程[14];AGEs對(duì)腎臟有直接毒性作用。研究表明，糖尿病腎組織中TGF-β1上調(diào)與AGES的增加關(guān)系密切，將AGEs注入正常鼠體內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)腎小球細(xì)胞外基質(zhì)和表達(dá)產(chǎn)物均有明顯增加，AGEs可以促進(jìn)腎臟合成、分泌TGF-β1[15]。

糖腎降濁顆粒中黃芪補(bǔ)脾益氣，溫運(yùn)陽(yáng)氣，益于消渴本身血瘀阻絡(luò)的治療，仝教授[16]善用黃芪祛瘀排濁;丹參活血逐瘀;水蛭通絡(luò)消瘀,血脈通暢，濕濁排瀉。茵陳歸脾胃，肝膽經(jīng)，主要化學(xué)成分為香豆素類,香豆素有擴(kuò)血管、降血脂，抗凝血作用,對(duì)實(shí)驗(yàn)性高膽固醇血癥家兔，茵陳煎劑組較對(duì)照組的血脂明顯下降，動(dòng)脈壁粥樣硬化減輕，內(nèi)臟脂肪沉著減少，主動(dòng)脈壁膽固醇含量減低[17]。知母、赤芍主治煩熱消渴，大便燥結(jié)，小便不利。王好古曰：“瀉肺火，滋腎水，治命門(mén)相火有余”?，F(xiàn)代研究也表明知母有較好的降血糖作用[18]。黃連可清泄中焦胃熱及諸臟之熱，使熱退則消谷減，火退則消渴愈，熱苦能治甜，使血糖得以調(diào)整。干姜性辛，溫，佐治黃連、知母過(guò)于苦寒，涼膩。“苦酸制甜”治其標(biāo)，直接針對(duì)高血糖[19]。

本研究結(jié)果可見(jiàn)，中藥組腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子β1明顯低于模型組，BUN、SCr和Pro水平顯著低于模型組，CRP、IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組。經(jīng)過(guò)糖腎降濁顆粒治療后大鼠腎組織中AGEs及轉(zhuǎn)移因子明顯減少，BUN、SCr和Pro水平顯著降低，CRP、IL-6和TNF-α含量顯著降低。因此，可以推測(cè)糖腎降濁顆粒具有抑制DN大鼠腎臟蛋白非酶糖基化作用，使AGEs積累減少、TGF-β1的表達(dá)下調(diào)，降低腎臟組織損害，減輕炎癥反應(yīng)，提示糖腎降濁顆粒對(duì)腎臟具有明顯的保護(hù)作用。

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EffectandMechanismofTangShenJiangZhuoGranuleonAGEsandTGF-β1inDiabeticNephropathyRats

XUXiao-wang1，XUXiao-xing2

(1.GuyeDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tangshan063101,China；2.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063100,China)

Objective:To observe the influences of Tangshen Jiangzhuo granule on advanced glycation end products(AGEs) and transforming growth factor β1(TGF-β1) in the nephridial tissues of diabetic nephropathy(DN) rats. Methods:Streptozotocin(STZ) was used to establish the DN model in rats by intraperitoneal injection. The rats were randomized into the model group, the western medicine group, and Chinese medicine group. After eight weeks, the content of AGEs and TGF-β1 were detected by immunohistochemical method. The levels of BUN(urea nitrogen), SCr(creatinine), Pro(urine protein)in blood, as well as CRP (C- reactive protein), IL-6 and TNF-α in kidney tissues were tested. Results:The contents and levels of AGEs, TGF-β1, BUN, SCr, Pro, CRP, IL-6, and TNF-a in the Chinese medicine group were all significantly lower than those of the model group(P<0.05). Conclusion:Tangshen Jiangzhuo granule may reduce the expressions of AGEs and TGF-β1, and depress the inflammatory responses to delay kidney damages.

Tangshen Jiangzhuo granule; AGEs; TGF-β1; Early diabetic nephropathy; Inflammatory factors

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃(No.2016236)

徐孝旺(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科。

2016-08-24

修回日期：2016-09-10

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0034-03