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    烏腺金絲桃對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影響

    2017-08-30 13:38:22朱潔宜吳鑫宇潘軍英付新李冀
    中醫(yī)藥信息 2017年5期
    關(guān)鍵詞:金絲類風(fēng)濕中醫(yī)藥大學(xué)

    朱潔宜,吳鑫宇,潘軍英,付新,李冀*

    (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

    烏腺金絲桃對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影響

    朱潔宜1,吳鑫宇1,潘軍英2,付新1,李冀1*

    (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

    目的:探討烏腺金絲桃治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法:復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型,隨機(jī)分為空白組、模型組、烏腺金絲桃高劑量組、烏腺金絲桃低劑量組、雷公藤多苷片陽性對(duì)照組,采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)各組大鼠血清中細(xì)胞因子白介素17(IL-17)、前列腺素E2(PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、干擾素γ(IFN-γ)的含量。結(jié)果:烏腺金絲桃高劑量組和低劑量組AA大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量與模型組相比顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論:烏腺金絲桃治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能與降低IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量有關(guān)。

    烏腺金絲桃;佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;IL-17;PGE2;MMP-9;IFN-γ

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病[1-2]。目前發(fā)病機(jī)制不明,難治性、復(fù)發(fā)性、致殘性貫穿該病的始終。該疾病的基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成,后期常會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形,使人致殘,該病無法治愈,所以對(duì)于控制病情的有效藥物研究一直在進(jìn)行。中醫(yī)藥治療RA有著悠久的歷史,且中藥具有毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[3-4]。烏腺金絲桃為民間常用中草藥,味苦,性平,歸心、肝經(jīng),有鎮(zhèn)痛的功效,主治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛。本研究復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,觀察IL-17、PGE2、MMP-9及IFN-γ含量的變化,意在探討烏腺金絲桃治療RA的可能作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    健康SD雄性大鼠50只,體質(zhì)量(200±20)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評(píng)價(jià)中心(GLP)提供;烏腺金絲桃(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供);完全弗氏佐劑(Sigma公司);雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字Z31020415);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司);低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中加分公司);ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);i-control Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組

    將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、烏腺金絲桃高劑量組(以下簡(jiǎn)稱高劑量組)、烏腺金絲桃低劑量組(以下簡(jiǎn)稱低劑量組)、雷公藤多苷片陽性對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱陽性組),每組10只。

    1.2.2 模型制備

    除空白組外,其余各組每只大鼠左后足拉直并于左后足跖皮下注射完全弗氏佐劑0.1 ml。

    1.2.3 藥物制備

    烏腺金絲桃全草剪碎,用16倍量蒸餾水浸泡60 min,冷凝回流提取藥液60 min并過濾,剩余藥渣用14倍量蒸餾水再次提取藥液40 min后濾出;剩余藥渣再以10倍量95%乙醇提取藥液30 min,再進(jìn)行一次30 min醇提,濾出,將4次水醇提取的藥液混合,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至所需的濃度,放置冰箱4℃保存。

    雷公藤多苷片研成粉末與蒸餾水充分混勻,制成濃度為0.1%的雷公藤多苷片混懸液,并加入0.01% 的懸混劑羧甲基纖維素鈉,放置冰箱4℃保存。

    1.2.4 給藥方法

    造模7日后開始灌胃給藥,每日1次,低劑量組灌服1.44 g/kg烏腺金絲桃提取液,高劑量組灌服5.76 g/kg烏腺金絲桃提取液[5-7],陽性組灌服9.45 mg/kg雷公藤多苷片混懸液,空白組、模型組以1.0 ml/100 g灌服生理鹽水,每組均連續(xù)給藥21天。

    1.3 血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量測(cè)定

    末次給藥后24 h內(nèi)大鼠禁食禁水,之后全部大鼠稱重,腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠(5 mlkg),經(jīng)頸總動(dòng)脈取血,將血置于采血管中,3 000 rmp離心15 min,取上清,保存于-20℃冰箱,采用ELISA法檢測(cè)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血清中IL-17、PGE2的含量比較

    由表1可知,模型組大鼠血清IL-17、PGE2的含量明顯升高,與空白組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而高、低劑量組和陽性組大鼠血清中IL-17、PGE2的含量均有所下降,與模型組比較,差異具差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

    表1 各組大鼠血清IL-17、PGE2的含量比較

    注:與空白組比較,△P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    2.2 各組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量比較

    由表2可知,模型組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量明顯升高,與空白組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);低劑量組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量與模型組相比差異顯著(P<0.05),而高劑量組、陽性組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量與模型組比較,具有極顯著性差異(P<0.01)。

    表2 各組大鼠血清MMP-9、IFN-γ的含量比較

    注:與空白組比較,△P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    3 討論

    RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,但相關(guān)研究表明其發(fā)病機(jī)制與一些細(xì)胞因子密切相關(guān)。

    IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌,其參與RA的炎癥反應(yīng)和進(jìn)行性損壞可通過多種途徑實(shí)現(xiàn)[8]。IL-17常通過與其他細(xì)胞因子的相互作用來促進(jìn)炎癥反應(yīng),從而介導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)節(jié)以致組織損傷[9]。還有研究表明,IL-17能促進(jìn)滑膜血管的增生,加重關(guān)節(jié)破壞,這是通過誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生金屬蛋白酶實(shí)現(xiàn)的[10]。本研究顯示,烏腺金絲桃可下調(diào)IL-17的含量,說明對(duì)抑制RA的炎癥和骨破壞有一定的作用,也通過這一機(jī)制證明了其治療RA的可能性。

    花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶代謝產(chǎn)生前列腺素,而前列腺素的合成與釋放體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)的全過程中。組織損傷和多種關(guān)節(jié)炎性疾病的產(chǎn)生與PGE2介導(dǎo)蛋白水解酶和炎性因子的產(chǎn)生是息息相關(guān)的[11],而RA的炎性滲出與PGE2改變血管通透性亦有關(guān)[12]。阻斷PGE2的產(chǎn)生可以治療RA,非甾體抗炎藥就是通過此途徑來發(fā)揮藥效的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),烏腺金絲桃可降低PGE2的含量,說明PGE2可能是烏腺金絲桃治療的RA機(jī)制之一。

    MMP-9是MMPs家族的成員,屬明膠酶類,有研究表明干擾素α可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞MMP-9的合成,加強(qiáng)炎性細(xì)胞的侵襲力,造成RA骨和軟骨的破壞[13],而血清MMP-9也可作為暫無骨破壞RA患者的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[14],亦有研究發(fā)現(xiàn)血管翳的形成與MMP-9促使滑膜下層血管生成有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),烏腺金絲桃高、低劑量組可明顯降低模型大鼠血清中MMP-9的含量,證明其可能通過MMP-9這一機(jī)制參與了RA的治療。

    IFN-γ是有著廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的干擾素,與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)[16],可刺激并增強(qiáng)RA的炎癥反應(yīng),參與關(guān)節(jié)軟骨等組織的損傷,且作為免疫刺激因子可以促使CD4+Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞的極化,促使免疫系統(tǒng)活化[17]。還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,下調(diào)血清及滑膜中IFN-γ的表達(dá),利于平衡Th1/Th2細(xì)胞,從而抑制滑膜局部細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),減輕關(guān)節(jié)滑膜炎和血管病變[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,烏腺金絲桃高、低劑量組可明顯下調(diào)模型大鼠血清中IFN-γ的含量,說明IFN-γ可能是烏腺金絲桃治療RA的作用機(jī)制之一,這為烏腺金絲桃治療RA的下一步深入研究提供了平臺(tái)。

    烏腺金絲桃,又名穩(wěn)心草、趕山鞭,味苦,性平,歸心、肝經(jīng),有止血、鎮(zhèn)痛、通乳的功效,主治咯血、吐血、子宮出血,風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛,跌打損傷,神經(jīng)痛,乳腺炎,乳汁缺乏,外用時(shí)常用來治療疔瘡腫毒和外創(chuàng)出血。之前對(duì)于烏腺金絲桃的研究多集中在化學(xué)成分、治療心臟病、抗抑郁等方面[19-20],本研究從新的角度出發(fā),分析其治療RA的可能性。而從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,烏腺金絲桃可從抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制骨破壞等方面發(fā)揮其治療RA的功效[21],這不僅為接下來的深入研究提供了基礎(chǔ),更為臨床治療RA的用藥提供了新思路。

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    EffectofHypericumAttenuatumChoisyonSerumLevelsofIL-17,PGE2,MMP-9andIFN-γinAdjuvantArthritisRats

    ZHUJie-yi1,WUXin-yu1,PANJun-ying2,FUXin1,LIJi1*

    (1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

    Objective:To investigate the mechanism of Hypericum Attenuatum Choisy(HAC) in the treatment of rheumatoid arthritis. Methods:The rats were randomly divided into the blank group, the model group, the high-dose HAC group, the low-dose HAC group, and the Tripterygium glycosides group. Adjuvant arthritis(AA) model was established in the other four groups except the blank group. The contents of interleukin 17(IL-17), prostaglandin E2(PGE2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and interferon γ (IFN- γ) in serum were tested by ELISA method. Results: The contents of IL-17, PGE2, MMP-9, and IFN- γ in the high-dose HAC group and the low-dose HAC group were significantly decreased compared to those in the model group(P<0.05 orP<0.01). Conclusion:The mechanism of HAC in the treatment of rheumatoid arthritis may be related to modulating IL-17, PGE2, MMP-9, IFN-γ.

    Hypericum Attenuatum Chosiy; Adjuvant arthritis model rats; Rheumatoid arthritis;IL-17;PGE2;MMP-9;IFN-γ

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81373536);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金面上項(xiàng)目(No.201722)

    朱潔宜(1988-),女,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)博士研究生。

    李冀*(1960-),男,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向:方劑配伍規(guī)律及作用機(jī)理研究。

    2016-12-16

    修回日期:2016-12-30

    R285.5

    :A

    :1002-2406(2017)05-0013-03

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