西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影響*

龔永謙，程愛蘭，劉潔

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫(yī)學院 病理學教研室，湖南 衡陽 421001）

西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤COX-2及MMP-7的影響*

龔永謙1，程愛蘭2，劉潔1

（1.南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫(yī)學院 病理學教研室，湖南 衡陽 421001）

目的 探討西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤環(huán)氧化酶-2（COX-2）及基質金屬蛋白酶-7（MMP-7）的影響。方法 選擇BALB/c裸鼠24只為研究對象，均復制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤模型，隨機分為西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組及對照組，各6只。對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，西妥昔單抗組腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液，順鉑組腹腔注射3μg/ml順鉑注射液，西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液和3 μg/ml順鉑注射液，連續(xù)4周后，脫頸處理裸鼠。比較瘤體生長情況、COX-2與MMP-7表達及信使核糖核酸（mRNA）表達。結果 西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積及瘤重均低于對照組（P＜0.05），西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積、瘤重低于西妥昔單抗組與順鉑組，抑瘤率高于西妥昔單抗組及順鉑組（P＜0.05）；西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7及mRNA表達均低于對照組（P＜0.05），西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組（P＜0.05）。結論西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療有助于抑制喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤增殖生長，可能與抑制腫瘤組織COX-2與MMP-7表達有關。

西妥昔單抗；順鉑；喉癌；環(huán)氧化酶-2；基質金屬蛋白酶-7

喉癌是頭頸部惡性腫瘤之一，占全身腫瘤的2%左右[1]，且有逐年增高的趨勢，手術是治療的主要方式。順鉑作為輔助治療手段可有效保全喉結構與功能，但也存在嚴重胃腸道反應、骨髓抑制等毒副作用。西妥昔單抗是臨床治療頭頸部腫瘤的靶向藥物之一，可抑制血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶的生成，誘導腫瘤細胞凋亡，且不增加惡心、嘔吐及骨髓抑制等并發(fā)癥[2-3]。兩組聯(lián)合應用于喉癌的文獻報道較少，本文通過復制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤模型的方法，探討西妥昔單抗聯(lián)合順鉑化療對人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及基質金屬蛋白酶 -7（matrix metalloprteinases-7，MMP-7）表達的影響，旨在分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c裸鼠24只。雌性；4～6周齡；體重15～30 g，平均（22.45±3.12）g；購于湖南省疾病控制中心實驗動物中心（許可證號SCXK20161015）。飼養(yǎng)條件：室溫（25.01±0.56）℃，相對濕度50%～60%，常規(guī)飼養(yǎng)1周后進行實驗。本研究經本院動物倫理委員會批準。

1.2 細胞株與藥物試劑

人喉鱗癌Hep-2細胞（中南大學湘雅醫(yī)學院動物實驗中心提供），西妥昔單抗（德國莫克公司，注冊證號 S2011009、規(guī)格 100 mg/20 ml、批號 151210），順鉑注射液（江蘇省連云港恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字 H20050962、規(guī)格 100 ml），COX-2 多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），MMP-7多克隆抗體（購自北京晶美生物工程有限公司），鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術有限公司），二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒（購自福建省福州邁新生物技術開發(fā)有限公司），Trizol試劑盒（購自美國Sigma公司），Taq DNA聚合酶、逆轉錄酶AMV（購自美國Progmega公司）。

1.3 主要儀器

超凈工作臺（江蘇省蘇州凈化設備有限公司SWCJ-1F型），低溫冰箱（日本 Sayyo公司MD-330），輪轉式切片機（上海江文信息技術有限公司），光學相差顯微鏡（日本Olympus公司CKX41型），Qwin standard 2.8病理圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.4 復制模型與分組

將復蘇后Hep-2細胞置于含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基細胞液中，放至37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞貼壁生長后取對數生長期細胞磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，配成 108/ml單細胞懸液，于裸鼠右側背部皮下注射100 μl，2周后觀察皮下腫瘤結節(jié)情況，當腫瘤直徑＞5 mm時提示模型復制成功。將模型復制成功的24只喉鱗癌模型裸鼠隨機分為西妥昔單抗組、順鉑組、西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組及對照組，每組各6只。

1.5 藥物干預

參照喬建兵等[4]的實驗方法實施藥物干預方案。對照組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，連續(xù)4周；西妥昔單抗組：腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液，連續(xù)4周；順鉑組：腹腔注射3μg/ml順鉑注射液，連續(xù)4周；西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組：腹腔注射1 036 μg/ml西妥昔單抗注射液和3 μg/ml順鉑注射液，連續(xù)4周。

1.6 瘤體體積與瘤體重量

4周末脫頸處理裸鼠，分離移植瘤，用游標卡尺測量瘤體長徑、短徑，計算瘤體體積，同時稱重，計算抑瘤率。將裸鼠腫瘤組織分為2部分：①用于免疫組織化學檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達；②用于檢測瘤組織COX-2、MMP-7信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達。抑瘤率=（對照組瘤體重量-實驗組瘤體重量）/對照組瘤體重量×100%。

1.7 腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達

參照試劑盒說明書，采用SP法檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7表達，用PBS代替一抗作陰性對照，用腫瘤組織作陽性對照。判斷標準：COX-2陽性細胞為細胞質可見棕黃色顆粒彌漫性分布，MMP-7陽性細胞為細胞質可見棕黃色顆粒染色。選擇染色良好區(qū)域，采用圖像分析軟件進行定量分析。

1.8 腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達

參照覃綱等[5]的方法檢測腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），用Trizol法提取腫瘤組織總RNA完成逆轉錄，采用PCR反應提取終產物電泳后，使用凝膠分析系統(tǒng)分析目的基因及β-actin積分吸光值，再用Biod-rad軟件分析mRNA表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，比較做方差分析，兩組比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組瘤體體積與瘤體重量變化情況

4周后，4組裸鼠重量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組：西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組瘤體體積及瘤重低于對照組（t=6.173、6.466、8.272、2.509、3.057 和 5.347，P=0.010、0.009、0.004、0.032、0.021 和 0.013），且西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組＜順鉑組＜西妥昔單抗組＜對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.324和3.456，P=0.010和0.026）實驗組抑瘤率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.324，P=0.018），西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組抑瘤率高于西妥昔單抗組與順鉑（t=8.984和 6.109，P=0.002和0.010），順鉑組抑瘤率高于西妥昔單抗組（t=2.781，P=0.028）。見表 1。

2.2 腫瘤組織COX-2、MMP-7表達

4周后，實驗組：西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7蛋白表達均低于對照組 （t=7.356、8.262、10.705、8.259 、9.450 和 12.076，P=0.006、0.004、0.000、0.004、0.000 和0.000）；西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達低于西妥昔單抗組、順鉑組（t=7.051、7.211、5.921 和 5.579，P=0.008、0.007、0.012和0.014）。見表2。

表1 4組裸鼠重量、瘤體體積、瘤重及抑瘤率比較 （n=6，±s）

表1 4組裸鼠重量、瘤體體積、瘤重及抑瘤率比較 （n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與西妥昔單抗組比較，P ＜0.05；3）與順鉑組比較，P ＜0.05

組別抑瘤率/%對照組 24.35±2.02 1 102.36±202.34 0.84±0.18 -西妥昔單抗組 24.12±1.65 568.12±63.211） 0.60±0.151） 28.57±3.12順鉑組 24.03±1.57 545.20±60.161） 0.57±0.121） 34.52±4.212）西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值裸鼠重量/g 瘤體體積/mm3瘤重/g23.28±1.721.1020.086 402.15±45.361）2）3）6.3240.010 0.41±0.081）2）3）3.4560.026 51.19±5.322）3）4.3210.018

2.3 腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達

4周后，實驗組：西妥昔單抗組、順鉑組及西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA 表達低于對照組（t=2.135、3.530、3.342、4.725、5.468 和 6.715，P=0.032、0.024、0.023、0.016、0.012 和0.010）；西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組（t=4.201和5.085，P=0.019和0.013)；順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達低于西妥昔單抗組（t=2.939和 3.424，P=0.030和 0.026）。見表 3。

表2 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達比較（n=6，±s）

表2 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達比較（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與西妥昔單抗組比較，P ＜0.05；3）西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組與順鉑組比較，P＜0.05

組別MMP-7對照組 138.69±22.14 136.45±18.21西妥昔單抗組 67.36±8.421） 70.02±7.521）順鉑組 60.25±7.121） 62.12±6.541）西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值COX-240.08±4.351）2）3）6.3250.009 43.02±5.251）2）3）8.6540.002

表3 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達比較（n=6，±s）

表3 4組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7 mRNA表達比較（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與西妥昔單抗組比較，P ＜0.05；3）與順鉑組比較，P ＜0.05

組別MMP-7 mRNA對照組 0.56±0.14 0.74±0.18西妥昔單抗組 0.41±0.101） 0.45±0.091）順鉑組 0.34±0.081） 0.36±0.081）西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組F值P值COX-2 mRNA0.22±0.061）2）3）4.0230.026 0.20±0.081）2）3）5.1230.01

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術的不斷發(fā)展以及腫瘤綜合治療手段的不斷進步，在治療喉鱗癌時，要求在不斷提高生存率的前提下，通過治療方式的改變，盡可能保留殘留喉結構與功能[6]，提高患者生存質量。靶向治療以其選擇性地作用于腫瘤組織細胞、減少對正常組織細胞的損害，越來越受到關注。

西妥昔單抗為抗EGFE人/鼠嵌合單克隆抗體，可競爭性結合于表皮生長因子受體，抑制癌細胞增殖[7-8]；也可通過上調Bax表達與抑制Bcl-2表達誘導腫瘤細胞凋亡；通過下調基質金屬蛋白表達抑制腫瘤細胞侵襲與轉移[9]。也有學者研究報道，腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞增殖失控、細胞凋亡受限密切相關，西妥昔單抗可誘導Hep-2細胞株阻滯于S期，造成DNA損傷不能進行有絲分裂，從而阻止腫瘤細胞增殖失控[10-11]。本研究中，西妥昔單抗組腫瘤體積、瘤重低于對照組，且西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組腫瘤體積、瘤重均低于西妥單抗組、順鉑組，說明西妥昔單抗對腫瘤細胞的增殖、凋亡有積極的促進作用。

COX-2是花生四烯酸合成前列腺素限速酶，在組織中表達與細胞因子、炎癥反應相關，可通過上調血管生長因子的表達促進腫瘤細胞局部浸潤和遠處轉移[12]；MMP-7由腫瘤細胞分泌，可通過降解細胞外基質加速腫瘤細胞侵入周圍組織，為腫瘤新生血管生長提供通道[13]。相關研究表明，COX-2、MMP-7在喉鱗癌細胞組織中均呈異常高表達狀態(tài)[14-15]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗組COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于對照組，西妥昔單抗聯(lián)合順鉑組裸鼠腫瘤組織COX-2、MMP-7表達及mRNA表達低于西妥昔單抗組、順鉑組，王文慧等[16]、CHUN等[17]也有類似的文獻報道。

綜上所述，本研究結果表明，西妥昔單抗聯(lián)合鉑類化療有助于抑制人喉鱗癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤增殖生長，可能與抑制細胞組織COX-2及MMP-7表達有關。本研究的局限性在于未對西妥昔單抗不同用藥劑量進行比較，且缺乏對其可能作用機制的深入分析，有待今后作進一步的研究。

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Impact of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor*

Yong-qian Gong1,Ai-lan Cheng2,Jie Liu1
(1.Department of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Pathology,School of Medicine,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo study effects of Cox-2 and MMP-7 of cetuximab combined with cisplatin on human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor and its mechanism.MethodsA total of 24 BALB/c human laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice were established,and were divided into cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group,blank control group.The control group was treated with intraperitoneal injection 0.9%sodium chloride solution 0.2 ml,the cetuximab group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection,cisplatin group with intraperitoneal injection 3 μg/ml cisplatin injection,and cetuximab combined with cisplatin group with intraperitoneal injection 1,036 μg/ml cetuximab injection and 3 μg/ml cisplatin injection.After four weeks,tumors growth,tumor tissue Cox-2 and MMP-7 protein expression and mRNA expression were compared.ResultsVolume and weight of tumors in the cetuximabgroup,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in the control group(P＜0.05).Volume and weight of tumors in the cetuximab combined cisplatin group were significantly lower than those in cetuximab group,cisplatin group,inhibition rate were significantly higher cetuximab group,cisplatin group(P＜0.05).Expression of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab group,cisplatin group,cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than those in the control group(P＜0.05).Expressions of COX-2,MMP-7 protein and mRNA in cetuximab combined cisplatin group were significanlty lower than cetuximab group,cisplatin group (P＜0.05).ConclusionsCetuximab combination with cisplatin chemotherapy helps to inhibit laryngeal neoplasms Hep 2 cells nude mice transplanted tumor proliferation and growth.It may related to inhibiting tumor tissue Cox-2 and MMP-7 expression.

cetuximab;cisplatin;laryngeal neoplasms;Cox-2;MMP-7

R696.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.005

1005-8982（2017）11-0026-05

2017-02-28

國家自然科學基金（No：81372894）；湖南省教育廳科研項目（No：10C1136）