MTA1基因沉默對宮頸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響

顧青 趙艷 陳華

（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海201999）

論著

MTA1基因沉默對宮頸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響

顧青 趙艷 陳華

（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海201999）

目的：探討MTA1基因沉默對宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移增殖的影響。方法：用慢病毒轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Siha細胞，轉(zhuǎn)染同時進行實驗分組。用RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡法測定宮頸癌Siha、Hela細胞中MTA1 mRNA和蛋白的表達。Transwell體外侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后Siha細胞的遷移能力，MTT檢測法和克隆形成實驗法檢測轉(zhuǎn)染后Siha細胞的細胞增殖能力，F(xiàn)ACS細胞凋亡法檢測轉(zhuǎn)染后Siha細胞的細胞凋亡率，PI-FACS細胞周期法檢測轉(zhuǎn)染后Siha細胞的各個生長周期的細胞數(shù)。結(jié)果：（1）Transwell體外侵襲實驗：相比NC組，KD組Transwell轉(zhuǎn)移率經(jīng)T-Test分析P=2.61E-08＜0.05。（2）MTT檢測結(jié)果表明：相比NC組，KD組細胞增殖減緩。（3）克隆形成實驗結(jié)果顯示：相比NC組，KD組克隆數(shù)經(jīng)T-Test分析P值=0.000 6＜0.05。（4）FACS細胞凋亡：相比兩個對照組，KD組凋亡率經(jīng)T-Test分析P＜0.05。結(jié)論：MTA1基因促進宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移和增殖，沉默MTA1基因表達能使宮頸癌細胞增殖及遷移能力下降，加速宮頸癌細胞的凋亡，為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移奠定實驗基礎(chǔ)，最后為宮頸癌的新型藥物性靶向治療提供有力的實驗依據(jù)。

宮頸癌；腫瘤轉(zhuǎn)移；MTA1基因

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一，其間涉及多種機制，包括癌細胞離開原有部位，通過血管和淋巴管浸潤，在內(nèi)皮細胞和基質(zhì)中滯留，誘導(dǎo)新的血管形成，逃避機體的腫瘤免疫監(jiān)視而形成新的轉(zhuǎn)移灶。宮頸癌是威脅全球婦女生命的第二常見腫瘤，轉(zhuǎn)移仍然是致死的主要原因。近年來，隨著腫瘤機制的深入研究，腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子被一一發(fā)現(xiàn)，腫瘤的靶向治療發(fā)展迅速，可能為宮頸治療帶來突破。大量研究表明，某些蛋白在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，其中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（Metastasis Associated Gene 1，MTA1）是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的蛋白之一。本實驗通過慢病毒感染技術(shù)沉默宮頸癌細胞中MTA1的表達，檢測宮頸癌細胞生物學行為的改變，為深入研究MTA1基因在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)介紹如下：

1 材料與方法

1.1 材料來源 人宮頸癌細胞系Siha（HPV16陽性的宮頸癌細胞）、Hela（HPV18陽性的宮頸癌細胞）由上海吉凱基因公司提供保存，Siha、Hela細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 高表達MTA1 mRNA和蛋白的宮頸癌細胞系的篩選 （1）逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR技術(shù)檢測Siha、Hela細胞中MTA1 mRNA的表達：分別提取Siha、Hela細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR方法擴增MTA1。MTA1基因的上游引物序列：AAGAAGGCGAGGAGGATGG，下游引物序列：ATCTGCTTGTCTGTGAGTGG，擴增片段長85 bp。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃，40 s，60 ℃，40 s，72 ℃，40 s，27個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。以β-actin為內(nèi)參基因，擴增片段長210 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。（2）Western Blot的方法檢測Siha、Hela細胞中目的基因的蛋白表達量。分別提取Siha、Hela細胞總蛋白，以β-actin為內(nèi)參照，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后與1:1 000稀釋的MTA1單克隆抗體（美國CST公司），4 ℃孵育過夜后，加入rabbit IgG二抗（美國Santa Cruz公司）孵育1.5 h，曝光顯影。選擇相對高表達MTA1 mRNA和蛋白的宮頸癌細胞系進行后續(xù)的基因沉默實驗。

1.2.2 Siha細胞的轉(zhuǎn)染及分組 將Siha細胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成（3～5）×104個/ml細胞懸液，按照預(yù)實驗結(jié)果，更換感染培養(yǎng)基，加入最適病毒量進行感染。選擇感染后8～12 h更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細胞感染效率達到80%以上。于感染48～72 h后，換用含抗生素（5 μg/ml puromycin）的培養(yǎng)基篩選細胞。轉(zhuǎn)染同時進行實驗分組：（1）Mock組：正常Siha細胞、未加病毒感染的細胞組；（2）NC組：正常Siha細胞、加陰性對照病毒CON077感染的細胞組；（3）KD組：正常Siha細胞、加MTA1基因shRNA病毒感染的細胞組。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后Siha細胞的遷移能力檢測 Transwell體外侵襲實驗法：將Transwell小室置于24孔板中，每個孔上室加入100 μl細胞懸液，下室內(nèi)加入600 μl 30% FBS培養(yǎng)基，每組設(shè)3個重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)12 h。取出Transwell小室，95%乙醇固定，用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細胞，Giemsa染色液進行細胞染色。顯微鏡下觀察并照相。以200 X的照片來計數(shù)，進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)染后Siha細胞的細胞增殖能力檢測 （1）MTT檢測法：將各實驗組細胞分別接種于96孔板中，進行細胞培養(yǎng)。分別在種植細胞后1、2、3、4、5 d收集細胞，置酶標儀檢測OD490值（反映了具有活力的細胞數(shù)量）。每組設(shè)5個平行孔，實驗重復(fù)3次。（2）克隆形成實驗法：將各實驗組細胞胰酶消化，于6孔板培養(yǎng)板中進行細胞接種，繼續(xù)培養(yǎng)到14 d，中途每隔3 d進行換液并觀察細胞狀態(tài)。實驗終止前熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照，PBS洗滌細胞1次。每孔加入1 ml 4%多聚甲醛，固定細胞30～60 min，PBS洗滌細胞1次。GIEMSA細胞染色，顯微鏡下進行克隆計數(shù)（鏡下每50個細胞算1個克隆）并照相。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后Siha細胞的細胞凋亡率檢測 Siha細胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化，收集細胞，預(yù)冷的D-Hanks洗滌細胞。200 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入10 μl Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min。根據(jù)細胞量，補加400～800 μl結(jié)合緩沖液，上機檢測。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后Siha細胞的生長周期檢測 Siha細胞經(jīng)相應(yīng)處理后，進行胰酶消化，收集細胞，預(yù)冷的D-Hanks洗滌細胞沉淀1次。1 300 rmp、5 min離心，4 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細胞至少1 h，進行細胞染色，上流式細胞儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料間的比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高表達MTA1 mRNA和蛋白的宮頸癌細胞系的篩選結(jié)果 RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡法檢測顯示，Siha細胞中MTA1 mRNA及蛋白的表達強度明顯高于Hela細胞。因此，本研究選擇相對高表達MTA1 mRNA和MTA1蛋白的Siha細胞進行后續(xù)的基因沉默實驗。見圖1，圖2。

圖1 RT-PCR測定兩種細胞中MTA1 mRNA的表達

圖2 WB測定兩種細胞中MTA1 mRNA的表達

2.2 轉(zhuǎn)染后Siha細胞生物學行為的改變

2.2.1 轉(zhuǎn)染后Siha細胞的遷移能力檢測 每孔的遷移細胞數(shù)（Migratory Cells Per Field）Mock組（209±3.82），NC組（222±1.87），KD組（78±0.78）。Migration Fold Change（細 胞 遷 移 的 變 化 率）Mock組（0.94±0.02），NC組（1.00±0.01），KD組（0.35±0.01）。Mock組 與NC組 對 比，P值=0.06。Mock與KD對比，P值=5.262E-07。KD與NC組對比，P值=2.61E-08。相比NC組，KD組Transwell轉(zhuǎn)移率經(jīng)T-Test分析P＜0.05。見圖3～5。

圖3 各實驗組在transwell小室內(nèi)孵育24 h后的轉(zhuǎn)移細胞數(shù)對比

圖4 各實驗組在transwell小室內(nèi)孵育24 h后的轉(zhuǎn)移細胞數(shù)與NC的變化值對比

圖5 Mock x 200 NC x 200 KD x 200

2.2.2 轉(zhuǎn)染后Siha細胞的細胞增殖能力檢測 （1）MTT檢測法：第5天的Mock組的OD490為（0.647± 0.003 9），NC組（0.637±0.003 6），KD組（0.363±0.005 7）。Mock組與NC組對比，P值= 0.022 9。Mock組與KD組對比，P值=3.77E-07。KD組與NC組對比，P值=2.5E-07。MTT檢測結(jié)果表明：相比NC組，KD組細胞增殖減緩。見圖6，圖7。

圖6 各實驗組在酶標儀對波長490 nm的光的吸收率隨時間變化的對比

圖7 各實驗組在酶標儀對波長490 nm的光的吸收率變化倍數(shù)的對比

（2）克隆形成實驗法：Mock組的克隆數(shù)（30±5），NC組（26±1），KD組（9±2）。Mock組與NC組對比，P值=0.309。Mock組與KD組對比，P值=0.002 5。KD組與NC組對比，P值=0.000 6?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示：相比NC組，KD組克隆數(shù)經(jīng)T-Test分析P＜0.05。見圖8，圖9。

圖8 各實驗組形成克隆數(shù)量的對比

圖9 Mock x 100 NC x 100 KD x 100

（3）轉(zhuǎn)染后Siha細胞的FACS細胞凋亡檢測：Mock組的凋亡率（1.65±0.064 3）%，NC組（4.66±0.058 7）%，KD組（8.63±0.271 9）%。Mock組與KD組對比，P值=1.7E-06。KD組與NC組對比，P值= 1.6E-05。相比兩個對照組，KD組凋亡率經(jīng)T-Test分析P＜0.05。見圖10。

圖10 MOCK、NC、KD組凋亡率對比

（4）轉(zhuǎn)染后Siha細胞的PI-FACS細胞周期檢測：Mock組在G1期（DNA合成前期）的細胞百分比為（55.15±1.0376）%，S期（DNA合 成 期）（18.8± 1.8143）%，G2/M期（DNA復(fù) 制 結(jié) 束）（26.06± 1.1647）%，NC組在G1期的細胞百分比為（57.34± 0.4159）%，S期（20.45±1.055）%，G2/M期（22.22± 0.5645）%。KD組與NC組對比，G1期的P值= 0.716，S期P值=0.908，G2/M期P值=0.0656，相比NC組，KD組處于S期、G1期和G2/M期的細胞數(shù)T-test分析P＞0.05。見圖11。

圖11 各實驗組處在G1、S以及G2/M期的細胞占細胞總數(shù)的比例對比

3 討論

MTA1基因是MTA家族成員之一，參與細胞核小體重組和組氨酸去乙?；瘡?fù)合物NuRD的形成，與組蛋白的去乙?；收嚓P(guān)，是轉(zhuǎn)錄過程中的一個輔助抑制因子。MTA1最初是Pencil等[1]于1990年首次應(yīng)用差異cDNA雜交技術(shù)從13762 NF大鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移系統(tǒng)篩選克隆出，繼后在人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞株中發(fā)現(xiàn)其對應(yīng)的人類同源物MTA1。因該基因的表達與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)，故被命名為轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1[2]。人的MTA1基因位于染色體14q32.3，編碼1個含715個氨基酸殘基的蛋白,分子量為82 kD。MTA1蛋白具有明顯的親水性,不具有跨膜或膜相關(guān)的區(qū)域，表明它并非細胞表面蛋白或分泌蛋白。因此，MTA1可通過此種功能直接或者間接作用于某些抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的基因，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄。有研究表明，MTA1在人類喉癌[3]、口腔鱗癌[4]、食管鱗癌[5]、鼻咽癌[6]及骨肉瘤[7]、子宮內(nèi)膜癌[8]、膀胱癌[9]等多種惡性腫瘤組織中均有不同程度的高表達，并與腫瘤的浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Rao等[10]發(fā)現(xiàn)Siha細胞株所表達的MTA1蛋白明顯高于HeLa細胞株，且與這兩株細胞的遷移及侵襲能力呈正比，用MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染Siha細胞株減少MTA1蛋白表達后，癌細胞的遷移、侵襲、黏附能力也明顯下降，而細胞的凋亡、增殖及細胞周期未受到影響。他們發(fā)現(xiàn)，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞中的P53蛋白表達明顯增多，β-catenin蛋白表達明顯減少。β-catenin在細胞內(nèi)有E-cadherin/β-catenin復(fù)合物與游離β-catenin兩種存在形式，其黏附功能主要是與E-cadherin的C末端直接作用，將其連接到細胞骨架的肌動蛋白上，形成細胞間穩(wěn)定連接。

在本研究中選用了RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡法測定了宮頸癌Siha、Hela細胞中MTA1 mRNA和蛋白的表達，選擇了相對高表達MTA1 mRNA和蛋白的Siha細胞進行后續(xù)的基因沉默實驗。用慢病毒轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Siha細胞，轉(zhuǎn)染同時進行了實驗分組：（1）Mock組：正常Siha細胞、未加病毒感染的細胞組；（2）NC組：正常Siha細胞、加陰性對照病毒CON0 77感染的細胞組；（3）KD組：正常Siha細胞、加MTA1基因shRNA病毒感染的細胞組。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：在Transwell體外侵襲實驗中：KD組相比NC組，Transwell轉(zhuǎn)移率經(jīng)T-Test分析P= 2.61E-08＜0.05，結(jié)果表明沉默MTA1基因表達能使宮頸癌細胞遷移能力下降。在MTT檢測及克隆形成實驗中顯示，MTA1基因促進宮頸癌細胞的增殖，沉默MTA1基因表達能使宮頸癌細胞增殖能力下降。對轉(zhuǎn)染后Siha細胞的PI-FACS細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)：KD組處于S期、G1期和G2/M期的細胞數(shù)與NC組相比，P＞0.05，無明顯差異性。在本研究中，對轉(zhuǎn)染后Siha細胞的FACS細胞凋亡進行檢測，Mock組的凋亡率（1.65±0.064 3）%，NC組（4.66±0.058 7）%，KD組（8.63±0.271 9）%，相比兩個對照組，KD組凋亡率經(jīng)T-Test分析P＜0.05，從而證明了沉默MTA1基因表達能加速宮頸癌細胞的凋亡，這與韓肖燕等[11]在以往這方面的研究發(fā)現(xiàn)有所不同。

總之，本研究結(jié)果表明，MTA1基因可以促進宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移和增殖，沉默MTA1基因表達能使宮頸癌細胞增殖及遷移能力下降，加速宮頸癌細胞的凋亡，為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移奠定實驗基礎(chǔ)，最后為宮頸癌的新型藥物性靶向治療提供有力的實驗依據(jù)。相信在不久的將來，我們將一步步揭開MTA1的完整作用機制，MTA1基因也有望成為腫瘤診斷與治療的重要參考指標。

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Effects of MTA1 Gene Silencing on the Metastatic and Proliferation of Cervical Cancer Cell

GU Qing, ZHAO Yan, CHEN Hua

(Department of Obstetrics and Gynecology, Shanghai Baoshan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai201999)

Objective: To investigate the effects of MTA1 gene silencing on the metastatic and proliferation ability of cervical cancer cell. Methods: The experiment was divided into three groups when the Siha cells were infected by lentivirus. Reverse transcription (RT)-PCR and western blot were used to detect MTA1 mRNA and protein expressions in Siha cell and Hela cell of cervical cancer. Transwell assay detected the migration ability of transfected Siha cells. The proliferation ability of transfected Siha cells were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and clone formation experiment. FACS cell apoptosis method detected apoptosis rate of transfected Siha cell. Flow cytometry detected transfected Siha cells at different growth periods. Results: (1) Transwell assay: Compared with NC group, the transfer rate in the KD group were analyzed by T Test (P=2.61＜0.05). (2)MTT test: Compared with NC group, the proliferation index of cells was signifcantly decreased in KD group. (3)Clone formation experiment: Compared with NC group, the numbers of cloning were signifcantly less than KD group (P=0.0006＜0.05). (4)FACS: Compared with NC group and Mock group,the apoptosis rate was signifcantly lower than KD group (P＜0.05). Conclusions: MTA1 gene may premote the metastasis and proliferation ability of cervical cancer cell.MTA1 gene silencing may decrease the proliferation and migration of cervical cancer cell, while accelerating the apoptosis of cervical cancer cell. It provides experiental basis for the inhibition of neoplasm metastasis, and powerful new experimental basis for cervical cancer drug targeted therapy fnally.

Cervical cancer; MTA1 gene; Neoplasm metastasis

R737.33

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.06.001

2017-05-04）