探討曠場實(shí)驗(yàn)評價脾氣虛和脾陽虛大鼠“神?！钡目赡苄约俺醪綑C(jī)制

劉文俊++高宇婷++竇智++于凱洋+++劉鳳智+++年宇婷+++單德紅

[摘要]目的 探討曠場實(shí)驗(yàn)評價脾氣虛和脾陽虛大鼠“神?！钡目赡苄约俺醪綑C(jī)制。方法 選取24只雄性SPF級SD大鼠作為研究對象，隨機(jī)分為對照組、脾氣虛組和脾陽虛組，每組8只；采用曠場實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠的運(yùn)動距離和站立次數(shù)；采用電鏡觀察各組的海馬神經(jīng)元線粒體形態(tài)學(xué)變化；采用比色法檢測各組海馬組織的ATP水平。結(jié)果 脾氣虛組和脾陽虛組在曠場實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動距離短于對照組，站立次數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；脾陽虛組在曠場實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動距離短于脾氣虛組，站立次數(shù)少于脾氣虛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；脾氣虛組和脾陽虛組大鼠的海馬神經(jīng)元線粒體均出現(xiàn)腫脹、空泡化，ATP水平均低于對照組（P<0.01）；脾陽虛組的ATP水平低于脾氣虛組（P<0.01）。結(jié)論 曠場實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^客觀地評價和區(qū)分脾氣虛和脾陽虛大鼠的“神?！?，其生物學(xué)基礎(chǔ)與海馬神經(jīng)元線粒體損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]神疲；脾氣虛；脾陽虛；曠場實(shí)驗(yàn)；線粒體

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（c）-0004-04

Exploration of open field test evaluating the mental fatigue of rats with spleen qi and spleen yang deficiency

LIU Wen-jun1 GAO Yu-ting2 DOU Zhi2 YU Kai-yang2 LIU Feng-zhi2 NIAN Yu-ting2 SHAN De-hong3▲

1.The Teaching Laboratory Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province，Shenyang 110847，China；2.The First Clinical College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province，Shenyang 110847，China；3.Faculty of Basic Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province，Shenyang 110847，China

[Abstract]Objective To explore the possibility and the preliminary mechanism of open field test evaluating the mental fatigue of rats with spleen qi deficiency （SQD） and spleen yang deficiency （SYD）.Methods 24 SPF male SD rats were selected as objects and they randomly divided into control group，SQD and SYD group，each group had 8 rats.The OFT method was used to detect the motion distance and vertical times.Electron microscope was used to observe the mitochondrial morphology of hippocampal neurons.ATP level in hippocampal tissues of each group were measured by colorimetry.Results Motion distance in open field test of SQD and SYD group was shorter than that of control group，and vertical times in SQD and SYD group was fewer than that of control group，and there was a statistical difference （P<0.05）.Motion distance in open field test of SYD group was shorter than that of SQD group，and vertical times in SYD group was fewer than that of SQD group，and and there was a statistical difference （P<0.01）.Hippocampus neuron mitochondria in SQD and SYD group showed swelling and vacuolization，and ATP level in SQD and SYD group were significantly lesser than that in control group （P<0.01），and ATP level in SYD group was lower than that in SQD group （P<0.01）.Conclusion OFT can be used to evaluate and rank the mental fatigue of rats of SQD，SYD objectively and its biological bases might related to the damage of hippocampus neuron mitochondria.

[Key words]Mental fatigue；Spleen qi deficiency；Spleen yang deficiency；Open field test；Mitochondrion

“神?！笔窃u價脾氣虛和脾陽虛大鼠模型的重要宏觀表征[1-5]，但其評價方法多為目測，客觀量化不足，不僅影響了模型復(fù)制的穩(wěn)定性和可靠性，還難以區(qū)分“神?！钡某潭?。曠場實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）是檢測嚙齒類動物在新環(huán)境中自發(fā)活動和探索行為的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，主要用于分析動物的認(rèn)知能力、緊張度、興趣度，在一定程度上反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的興奮程度[6-8]。本研究嘗試將OFT用于客觀評價脾氣虛、脾陽虛模型大鼠的“神?！保暮ｑR線粒體方面揭示其可能依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組

選取24只SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購于本溪實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK（遼）-2010-0001]，隨機(jī)分為對照組、脾氣虛組和脾陽虛組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水進(jìn)食，（20±2）℃，相對濕度45%～55%。

1.2模型復(fù)制方法

脾氣虛證模型復(fù)制方法參考文獻(xiàn)[9-10]：脾氣虛組大鼠施加飲食不節(jié)加力竭游泳刺激，即先飽食1 d，再禁食2 d，自由飲水；每日游泳至力竭，水溫35～37℃，連續(xù)15 d。脾陽虛證模型復(fù)制方法：取脾氣虛模型大鼠每日灌服20%番瀉葉水浸劑（2 ml/100 g），早晚各1次，連續(xù)7 d。

1.3模型評價標(biāo)準(zhǔn)及方法

脾氣虛證的評價標(biāo)準(zhǔn)如下。①消瘦：體質(zhì)量明顯下降；②食少：代謝籠計(jì)量24 h單只進(jìn)食量和飲水量，均明顯減少為達(dá)標(biāo)；③乏力：雙前肢抓力明顯變小，檢測方法見文獻(xiàn)[10]；④被毛枯槁無華：三人分別觀察且一致認(rèn)定。脾陽虛證的評價標(biāo)準(zhǔn)如下。前述標(biāo)準(zhǔn)加①畏寒：9～10時測大鼠肛溫，明顯下降為達(dá)標(biāo)；②便?。杭S便含水率明顯升高。

1.4 OFT方法

采用成都泰盟TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行檢測。將大鼠放入箱體中心，主要觀察5 min內(nèi)大鼠的運(yùn)動距離、站立次數(shù)等。徹底清潔箱體后，檢測下1只大鼠。

1.5海馬神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)觀察

大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.4 ml/100 g）麻醉后，在4℃下將海馬切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗后1%鋨酸固定，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋聚合，LKB-1型超薄切片機(jī)切片（50～60 nm厚），3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，日本電子JEM-1011透射電鏡觀察并拍片。

1.6海馬組織ATP水平

采用比色法，試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司（A095）。應(yīng)用Bio-Rad美國伯樂iMark酶標(biāo)儀，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。

2結(jié)果

2.1 模型評價

對照組大鼠體格健壯，反應(yīng)靈敏，被毛緊密有光澤；脾氣虛組大鼠消瘦，反應(yīng)遲鈍，被毛蓬起枯槁無光澤；脾陽虛組大鼠消瘦，反應(yīng)遲鈍，被毛枯槁無光澤，肛周污穢，墊料潮濕。由表1可見，脾氣虛組前4項(xiàng)均明顯低于對照組（P<0.05），說明該組大鼠出現(xiàn)消瘦、食少和乏力；脾陽虛組除大便含水率顯著升高（P<0.01）外，其余指標(biāo)均顯著低于對照組（P<0.01），表明該組大鼠出現(xiàn)消瘦、食少、乏力、畏寒和便稀。以上結(jié)果表明二證大鼠模型復(fù)制成功。

2.2 OFT結(jié)果

由圖1和表2可見，對照組大鼠的活動區(qū)域以角落和四周為主，脾氣虛組大鼠在中心活動增多，但其運(yùn)動距離和站立次數(shù)均顯著低于對照組（P<0.05）；而脾陽虛組活動范圍最小，甚至沒有形成閉合運(yùn)動軌跡，其運(yùn)動距離和站立次數(shù)均顯著低于對照組和脾氣虛組（P<0.05），表2亦顯示了后兩組和對照組的相對值。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與脾氣虛組比較，△△P<0.01

2.3大鼠海馬神經(jīng)元線粒體形態(tài)及ATP含量

由圖2可見，對照組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)線粒體形態(tài)基本正常，數(shù)量較多，而脾氣虛和脾陽虛組線粒體均出現(xiàn)腫脹、空泡化，數(shù)量較少。三組大鼠海馬組織ATP水平分別是（1.32±0.60）、（0.81±0.38）和（0.28±0.13）pmol/mg，后兩組顯著低于對照組（P<0.05），且脾陽虛組顯著低于脾氣虛組（P<0.01）。

3討論

正常動物進(jìn)入曠場后，因畏懼開闊、未知和存在潛在危險的環(huán)境而“貼墻”活動，適應(yīng)后再進(jìn)行探索，嘗試通過中心區(qū)域，并不時站立[12-13]。因?yàn)镺FT能夠較好地反映CNS的興奮程度，所以本實(shí)驗(yàn)將其用于評價大鼠的“神疲”。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組大鼠活動范圍大，運(yùn)動距離遠(yuǎn)，站立次數(shù)多，反映其CNS較為興奮；脾氣虛組大鼠的活動區(qū)域雖然也較大，但其運(yùn)動距離和站立次數(shù)均顯著低于對照組，提示其CNS興奮度較低，出現(xiàn)了“神?！睜顟B(tài)；而脾陽虛組大鼠的活動范圍明顯變小，且運(yùn)動距離和站立次數(shù)不僅低于對照組，也低于脾氣虛組，表明該組大鼠的CNS興奮性明顯下降。

由于神疲與脾虛所致氣血虧虛、神失所養(yǎng)有關(guān)，而脾陽虛多源于脾氣虛，故脾陽虛之神疲要甚于脾氣虛之神疲，但臨證對此并不詳查，蓋因區(qū)分此二證主要看是否有寒象。不過對于實(shí)驗(yàn)研究，特別涉及神經(jīng)科學(xué)，還是有必要量化區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)觀察到，后兩組的運(yùn)動距離分別為對照組的51.83%、8.79%，站立次數(shù)分別是對照組的73.94%、24.24%，表明脾陽虛之“神?！币跤谄馓撝吧衿！?，這與中醫(yī)理論一致。由此可以認(rèn)為，OFT可以用來較為客觀地評價和區(qū)分脾氣虛和脾陽虛的“神?！?。

由于大鼠行為學(xué)表現(xiàn)與海馬關(guān)系密切，本文進(jìn)一步從海馬線粒體方面探討“神疲”的發(fā)生原因[14-17]。結(jié)果顯示，后兩組大鼠海馬神經(jīng)元的線粒體均出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷和數(shù)量減少，且ATP水平明顯下降，提示在脾氣虛和脾陽虛時海馬能量不足，這種可能是氣血不足、神失所養(yǎng)的一個表現(xiàn)。而脾陽虛組海馬線粒體損傷和ATP水平下降要甚于脾氣虛組，則可能是該組大鼠“神疲”程度重于脾氣虛組的原因之一[18-19]，因此，海馬線粒體損傷可能是OFT能夠較好地評價脾氣虛和脾陽虛大鼠“神?！钡纳飳W(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為曠場實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地評價和區(qū)分脾氣虛和脾陽虛大鼠的“神?！保渖飳W(xué)基礎(chǔ)與海馬神經(jīng)元線粒體損傷有關(guān)。

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（收稿日期：2017-05-22 本文編輯：許俊琴）