CYP2C9基因多態(tài)性在房顫患者華法林抗凝治療中的意義

呂游++楊杰孚

[摘要] 目的 研究漢族人群CYP2C9基因多態(tài)性對房顫患者華法林抗凝治療的意義，探討華法林用藥個體差異顯著的原因。 方法 對北京醫(yī)院住院治療的符合研究入選標(biāo)準(zhǔn)的100例應(yīng)用華法林抗凝治療的房顫患者提取靜脈血DNA，并用聚合酶鏈反應(yīng)分別從基因組DNA中特異性擴(kuò)增CYP2C9基因的第3號外顯子及第7號外顯子，對DNA產(chǎn)物測序分析，計算其基因型和等位基因頻率，同時記錄患者基本信息、服藥期間的華法林用藥劑量及凝血功能。 結(jié)果 100例因房顫應(yīng)用華法林抗凝治療患者中共篩選到兩種等位基因：CYP2C9*1和CYP2C9*3，等位基因頻率分別為96%和4%。同時，CYP2C9基因多態(tài)性共檢測到兩種基因型，以CYP2C9*1/*1基因型常見，基因型頻率為92%；其次為CYP2C9*1/*3型，基因型頻率為8%。在達(dá)到抗凝指標(biāo)（國際標(biāo)準(zhǔn)化比值INR 2.0～3.0）后，CYP2C9*1/*3突變型患者的華法林維持劑量為（2.14±0.55）mg，低于CYP2C9*1/*1野生型組的平均劑量[（3.17±0.74）mg]，兩組間劑量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 CYP2C9基因多態(tài)性與房顫患者華法林抗凝治療維持劑量有關(guān)系，可以部分解釋華法林用藥個體差異的原因。

[關(guān)鍵詞] 房顫；CYP2C9；基因多態(tài)性；華法林；抗凝治療

[中圖分類號] R541.75 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（b）-0004-04

The role of the polymorphism of CYP2C9 in Warfarin anticoagulation therapy for patients with atrial fibrillation

LYU You YANG Jiefu

Department of Caidiology， Beijing Hospital， Beijing 100730， China

[Abstract] Objective To investigate the significance of CYP2C9 gene polymorphism in Warfarin anticoagulation therapy for patients with atrial fibrillation， in order to explore the causes of Warfarin individual difference. Methods The 3rd and 7th exon of CYP2C9 in 100 patients with atrial fibrillation given Warfarin anticoagulation therapy in Beijing Hospital were detected by PCR and restriction enzyme digestion. The genotype and allelic frequencies were calculated and patients information， coagulation function and the individual Warfarin dosage requirements were recorded. Results In this group of patients with atrial fibrillation given Warfarin anticoagulation therapy， two kinds of allele were detected： CYP2C9*1 and CYP2C9*3， the frequency of *1 allele and *3 allele was 96% and 4% respectively. CYP2C9*1/*1 was the most common genotype， with the frequency of 92%. The frequency of CYP2C9*1/*3 was 8% in these 100 patients. After similar target INR range （2.0-3.0） achieved， variant CYP2C9*1/*3 homozygotes or heterozygotes required lower daily mean maintain doses [（2.14±0.55） mg] than wild-type CYP2C9*1/*1 patients did [（3.17±0.74） mg]， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Polymorphism of CYP2C9 is associated with Warfarin dose requirements in patients with atrial fibrillation， which is partly the factor causing Warfarin individual difference .

[Key words] Atrial fibrillation； CYP2C9； Genetic polymorphism； Warfarin； Anticoagulation therapy

心房顫動是臨床中最常見的心律失常類型，心房顫動對患者的主要危害是缺血性腦卒中風(fēng)險升高。為了預(yù)防房顫患者缺血性腦卒中的發(fā)生，臨床中最常用的方法是進(jìn)行華法林抗凝治療。房顫患者華法林抗凝治療的指征根據(jù)CHADS2評分：高血壓病史1分，慢性心力衰竭病史1分，有卒中或短暫性腦缺血2分，年齡>75歲為1分，糖尿病病史為1分。對于積分≥2分的患者需進(jìn)行抗凝治療[1]。研究結(jié)果表明，恰當(dāng)?shù)娜A法林抗凝治療可減少68%的卒中風(fēng)險，使腦卒中的發(fā)生率從4.5%下降到1.4%[2]。華法林有著嚴(yán)格的治療窗，目前華法林的臨床治療多根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）進(jìn)行劑量的調(diào)整，要求維持INR在2.0～3.0之間，劑量不足難以達(dá)到預(yù)期抗凝療效，而劑量過大則可引起出血。據(jù)統(tǒng)計華法林引起的致死性出血、嚴(yán)重出血、輕微出血發(fā)生率分別是0.6%、3%、9.5%，嚴(yán)重出血4年累計發(fā)生率約為25%[3]。中國人華法林的平均維持劑量為3.45 mg/d，但實際使用范圍為1～60 mg/d[4]。造成華法林個體差異性大的原因諸多，包括年齡、體表面積、遺傳、藥物、飲食、飲酒、肝功能和其他未知因素。遺傳因素中，肝藥酶細(xì)胞色素P450中CYP2C9的基因多態(tài)性起到重要作用。本實驗通過測定房顫患者的CYP2C9基因型和基因頻率，并與臨床中應(yīng)用華法林后達(dá)到抗凝指標(biāo)的平均維持劑量相比對，明確不同基因型的患者應(yīng)用華法林維持劑量的差異，初步探尋華法林藥物個體差異性的部分原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年2月～2016年3月共收集北京醫(yī)院（以下簡稱“我院”）服用華法林抗凝的房顫患者100例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①中國漢族人群；②未同時服用影響華法林代謝的藥物；③未患有影響凝血功能的疾病，如血液系統(tǒng)疾病、肝功能異常、惡性腫瘤等；④對本研究詳細(xì)了解，獲取完全知情同意的患者。本研究已通過我院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 對于符合入選標(biāo)準(zhǔn)的房顫患者，記錄其基本臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重，追蹤患者應(yīng)用華法林抗凝治療前、治療達(dá)到穩(wěn)定之后的凝血功能，以及華法林應(yīng)用的維持劑量。

1.2.2 血標(biāo)本采集 收集入選受試者的靜脈血（枸櫞酸鈉抗凝）2 mL于-80℃冰箱貯存，用于檢測CYP2C9基因型。

1.2.3 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 用EDTA抗凝真空采血管收集外周血2 mL，采用鹽析法提取基因組DNA，-20℃儲存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI提供信息及相關(guān)文獻(xiàn)[5]，CYP2C9*2為第3外顯子430C>T突變，設(shè)計正向引物F：TACAAATACAATGAAAATATCATG，反向引物R：CT？鄄AACAACCAGGACTCATAAT；CYP2C9*3為第7外顯子1075A>C突變，設(shè)計正向引物F：CCCCTGAATT？鄄GCTACAACAAA，反向引物R：ACCCGGTGATGGTAGAGGTT。PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增采用25 μL的反應(yīng)體系，內(nèi)含2×Taq mix（內(nèi)含dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶），100 ng的基因組DNA，上下游引物均為0.2 μmol/L。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后再延伸5 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物濃度測定及電泳驗證產(chǎn)物 取PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物5 μL，應(yīng)用分光光度法測定產(chǎn)物濃度，均滿足基因測試要求。CYP2C9第七外顯子產(chǎn)物擴(kuò)增長度為690 bp，第三外顯子產(chǎn)物擴(kuò)增長度為345 bp，通過電泳驗證目標(biāo)產(chǎn)物，見圖1～2。

圖2 CYP2C9第三外顯子產(chǎn)物電泳圖

1.2.5 INR值測定 取患者外周靜脈抗凝血2 mL，分別測定用藥前基礎(chǔ)INR及應(yīng)用華法林抗凝治療達(dá)到穩(wěn)定后的INR值，測定結(jié)果由我院檢驗科化驗室提供。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征

本次試驗共入選100例房顫患者，其中，男64例，女36例；年齡為19～83歲，平均（63.17±13.18）歲；男性平均年齡為（62.66±14.51）歲，女性平均年齡為（64.63±12.74）歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 患者基因及基因型檢測結(jié)果

患者DNA測序服務(wù)由深圳華大基因研究院提供。根據(jù)患者DNA測序結(jié)果，應(yīng)用Seqman及Chromas軟件分析其目標(biāo)位點突變情況，見圖3～4。

箭頭所指示的紅色T位點是所要研究的位點，它的對應(yīng)互補(bǔ)位點為A，該位置無雜峰，表示同源染色體為純合子AA型，即野生純合型

箭頭所示第80編號T位，對應(yīng)的互補(bǔ)位點為A，T峰下方可見黑色G峰，表示同源染色體為雜合子AC型，為雜合突變體

在研究的100例房顫患者中，以CYP2C9*1/*1基因型最為多見，基因型頻率高達(dá)92%；其次，為CYP2C9*1/*3基因型，基因型頻率為8%。未檢出CYP2C9*1/*2、CYP2C9*2/*2、CYP2C9*3/*3型。等位基因以CYP2C9*1型最為常見，等位基因頻率為96%，等位基因CYP2C9*3型等位基因頻率為4%。

CYP2C9*1/*1基因型共有92例，其中，男59例，女33例；CYP2C9*1/*3基因型共有8例，其中，男5例，女3例。兩組在年齡、性別分布、身高、體重方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 CYP2C9不同基因型患者的華法林維持劑量

在入選的100例房顫患者中，CYP2C9*1/*1基因型組的華法林維持劑量為（3.17±0.74）mg，CYP2C9*1/*3基因型組的華法林維持劑量為（2.14±0.55）mg，兩組間劑量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

3.1 遺傳因素在華法林個體差異性中的地位

華法林是由S-型和R-型組成的混合化合物。優(yōu)映體為S-華法林，其主要通過細(xì)胞色素P450酶CYP2C9代謝，R-華法林主要通過CYP3A4、1A1、1A2代謝[6]。在所有的藥物代謝酶中，CYP2C9酶對華法林代謝的影響最大，被研究的也最多。編碼該代謝酶的基因為CYP2C9，野生基因型為CYP2C9*1/*1，主要的兩種突變類型，即*2和*3突變。*2突變表現(xiàn)為430位點C>T，*3突變表現(xiàn)為1075位點A>C，兩種突變類型均可使藥酶活性降低[7]。在本實驗的100例患者中，未檢出*2的突變類型，這與其在黃種人群中分布規(guī)律相一致[8]。所檢出的8例CYP2C9*1/*3突變型患者的華法林維持劑量低于野生型組的平均劑量，兩組間劑量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。再次驗證了CYP2C9基因多態(tài)性在華法林個體差異性中的作用。

多項研究表明，維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物（VKORC1）的基因多態(tài)性也影響著華法林的個體差異，維生素K經(jīng)VKORC1作用由環(huán)氧化物轉(zhuǎn)化成氫醌形式，參與體內(nèi)凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及蛋白C、S的活化[9-10]。華法林的藥理機(jī)制是通過抑制VKORC1的活性，抑制維生素K由環(huán)氧化物轉(zhuǎn)化成氫醌形式，從而阻斷凝血因子的活化，以達(dá)到抗凝的目的。自從Rost等[9]報道了VKORC1基因以來，已有多項研究證實，VKORC1基因多態(tài)性也影響著華法林的藥物代謝。該基因主要突變的位點有-1173C>T、-3730G>A和-1639A>G。有文獻(xiàn)報道，VKORC1基因的多態(tài)性對華法林劑量的影響可達(dá)25%，高于CYP2C9基因多態(tài)性對華法林的影響（6%）[11]。Miao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，VKORC1-1639GA患者華法林平均每日劑量為（3.32±1.02）mg，高于野生型-1639AA的日均劑量（1.76±0.57）mg，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。Yuan等[13]發(fā)現(xiàn)，日本缺血性卒中患者中，基因型為-1639GA的患者，其華法林日平均劑量[（3.70±1.11）mg]高于基因型為-1639AA的患者[（2.83±1.00）mg]，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。意大利研究證實，VKORC1基因型為-1173CC的患者，其華法林的日平均劑量為6.2 mg，高于基因型為-1173CT和-1173TT的患者，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）[14]。綜上可見，攜帶-1639G、-1173C及-3730A的患者，其對華法林的需求量較野生基因型患者高。本實驗限于條件和經(jīng)費(fèi)的因素，并未將VKORC1的基因多態(tài)性同時進(jìn)行研究，為一缺憾。

3.2 華法林藥物模型建立的意義

由于華法林用藥治療窗口窄，個體差異大，影響因素繁多，需要臨床反復(fù)監(jiān)測凝血功能，并可能出現(xiàn)嚴(yán)重的出血并發(fā)癥，因此在臨床中的使用率一直較低[15]。1998年Oates等[16]研究了患者的多種臨床因素與華法林劑量需求的關(guān)系。結(jié)果表明：性別、臨床聯(lián)合用藥、心臟功能不全、連續(xù)使用華法林兩周后的基線INR水平與華法林的維持劑量顯著相關(guān)。Kamali等[17]建立包括年齡及CYP2C9基因多態(tài)性在內(nèi)的給藥模型，其相關(guān)系數(shù)為20.4%。自VKORC1基因與華法林劑量需求的關(guān)系被研究以后，有多篇文獻(xiàn)報道了基于CYP2C9基因多態(tài)性和VKORC1基因多態(tài)性模擬出的華法林給藥模型，這些模型的相關(guān)系數(shù)為40%～60%[18]。目前國際華法林藥物遺傳學(xué)聯(lián)盟（the International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium，IWPC）制訂的IWPC華法林劑量預(yù)測算法[19]最具權(quán)威性，該研究納入了4大洲9個國家/地區(qū)共計4043例以華法林治療患者的臨床和基因?qū)W資料進(jìn)行分析，其包含的變量有CYP2C9、VKORC1、身高、體重、種族、是否同時使用酶誘導(dǎo)劑或胺碘酮等。

如果通過多因素的研究建立出符合漢族人群的華法林給藥方案公式，在處方華法林前先對患者進(jìn)行相關(guān)基因型的檢測分析，并根據(jù)藥物模型計算華法林的使用劑量，無疑將會對房顫患者臨床抗凝治療產(chǎn)生積極深遠(yuǎn)的作用，值得廣大醫(yī)學(xué)研究者進(jìn)行深入探索。

綜上所述，CYP2C9基因多態(tài)性可以部分解釋房顫患者華法林用藥個體差異性的原因，CYP2C9*1/*3突變型患者的平均華法林維持劑量低于CYP2C9*1/*1野生型的平均維持劑量。華法林在臨床應(yīng)用中受多種因素影響，大樣本量、多因素的研究以及基于多因素的藥物模型的建立，將對華法林的臨床使用起到更好的指導(dǎo)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Hirshj，F(xiàn)uster V，Ansell J，et al. American heart association/American college of cardiology foundation guide to warfarin therapy [J]. Circulation，2003，107（5）：1692-1711.

[2] Aronow WS. Management of atrial fibrillation in the elderly [J]. Minerva，2009，100（12）：3-24.

[3] Zaidenstein R，Eyal S，Efrati S. Adverse drug events in hospitalized patients treated with cardiovascular drugs and anticoagulants [J]. Pharmacoepidemiol Drug Safety，2002， 11（9）：235–238.

[4] Yoon YR，Shon JH，Kim MK，et al. Frequency of cytochrome P450 2C9 mutant alleles in a Korean population [J]. Br J Clin Pharmacol，2001，51（3）：277-280.

[5] Allabi C，Galaj L，Horsmansy，et al. Functional impact of CYP2C9*5，CYP2C9*6，CYP2C9*8，and CYP2C9*11 in viv among black Africans [J]. Clin Pharmacol Ther，2004， 76（2）：113-118.

[6] Yin T，Miyata T. Warfarin dose and the pharmacogenomics of CYP2C9 and VKORC1-rationale and perspectives [J]. Thromb Res，2007，120（10）：1-10.

[7] Sanderson S，Emery J，Higgins J. CYP2C9 gene variants，drug dose，and bleeding risk in warfarin-treated patients：a HuGEnet systematic review and meta-analysis [J]. Genet Med，2005，17（7）：97-104.

[8] Chern HD，Zeng TH，F(xiàn)u YP，et al. CYP2C9 polymorphism and warfarin sensitivity in Taiwan Chinese [J]. Clin Chim Acta，2006，367（8）：108-113.

[9] Rost S，F(xiàn)regin A，Ivaskevicius V，et al. Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type [J]. Nature，2004，42（7）：537-541.

[10] Li T，Lang LA，Li X，et al. Polymorphisms in the VKORC1 gene are strongly association with warfarin dosage requirements in patients receiving anticoagulation [J]. J Med Genet，2006，43（4）：740-744.

[11] Reiner MJ，Reiner AP，Gage BF，et al. Effect of VKORC1 haplotypes on transcrip tional regulation and warfarin dose [J]. N Engl J Med，2005，352（5）：2285-2293.

[12] Miao L，Yang J，Huang C，et al. Contribution of age，body weight，and CYP2C9 and VKORC1 genotype to the anticoagulant response to warfarin：proposal for a new dosing regimen in Chinese patients [J]. Eur J Clin Pharmacol，2007， 69（13）：1135-1141.

[13] Yuan HY，Chen JJ，Lee MT，et al. A novel functional VKORC1 promoter polymorphism is association with inter-individual and inter-ethnic differences in warfarin sensitivity [J]. Hum Mol Genet，2005，14（3）：1745-1751.

[14] D′Andrea G，D′Ambrosio RL，Di Perna P，et al. A polymorphism in the VKORC1 gene is association with an interindividual variability in the dose- anticoagulant effect of warfarin [J]. Blood，2005，105（11）：645-649.

[15] 戚文航.中國部分地區(qū)心房顫動住院病例回顧性調(diào)查[J].中華心血管病雜志，2003，31（11）：913-916.

[16] Oates A， Jackson PR，Austin CA，et al. A new regimen for starting warfarin therapy in out-patients [J]. Br J Clin Pharmacol，1998，46（9）：157-161.

[17] Kamali F，Khan TI，King BP，et al. Contribution of age，bodysize，and CYP2C9 genotype to anticoagulant response to warfarin [J]. Clin Pharmacol Ther，2004，75（12）：204-212.

[18] Wu AH，Wang P，Smith A，et al. Dosing algorithm forwarfarin using CYP2C9 and VKORC1 genotyping from a multi-ethnic population comparison with other equations [J]. Pharmacogenomics，2008，9（23）：169-178.

[19] Klein TE，Altman RB，Eriksson N，et al. Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data [J]. N Engl J Med，2009，360（8）：753-764.

（收稿日期：2017-04-02 本文編輯：程 銘）