松材線蟲與擬松材線蟲雜交試驗及后代繁殖力研究

徐紅梅+陳京元+湯景明

摘要：松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus和擬松材線蟲B.mucronatus是傘滑刃屬內(nèi)兩個獨立的種，均可引起松材線蟲病。松材線蟲與擬松材線蟲能否進行種間雜交在學術(shù)界一直存在爭議。采用4個蟲株在實驗室條件下開展了雜交試驗及雜交后代繁殖力研究。結(jié)果表明：實驗室條件下松材線蟲和擬松材線蟲可成功雜交，他們之間未發(fā)展出嚴格的生殖隔離，二者極可能來源于同一祖先。

關(guān)鍵詞：松材線蟲；擬松材線蟲；雜交

中圖分類號：S763.16文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2017）03-0029-05

Abstract： As two different species in genus Bursaphelenchus，B.xylophilus and B.mucronatus can cause pine wilt disease.There has been a long running debate on whether the two species can hybridize successfully.In this study indoor hybridization were carried out with four isolates of B.xylophilus and B.mucronatus.The fecundity of their offsprings was also observed.The results showed that interspecific hybridization between B.xylophilus and B.mucronatus was possible under the laboratory condition. Cross tests showed that there was no strict reproductive isolation between them，and they were derived from a common ancestor.

Key words：B.xylophilus；B.mucronatus；hybridization

松材線蟲?。ㄋ蓸湮璨。┍环Q為松樹的“癌癥”，是林業(yè)上的一種毀滅性病害。松材線蟲是普遍認可的引起松材線蟲病的主要病原物[1]。20世紀 80 年代起，中國陸續(xù)發(fā)現(xiàn)由擬松材線蟲引起的松樹萎蔫，且能造成一定的危害。近年來大量研究也證實一些擬松材線蟲蟲株確實有較強致病性，如對黃山松和黑松、云南松及思茅松、高山松等，并導致很多松林被毀[2-4]。因此，不少學者認為松材線蟲和擬松材線蟲共同構(gòu)成松材線蟲復合群體，為松材線蟲病的病原物。

松材線蟲和擬松材線蟲是傘滑刃屬內(nèi)兩個獨立的種，在寄主植物、形態(tài)、生理生化等方面都極為相似。近年來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)形態(tài)特征、分子生物學特征及致病性方面都介于松材線蟲和擬松材線蟲之間的線蟲群體，例如法國擬松材線蟲群體以及“M”型松材線蟲群體。松材線蟲與擬松材線蟲作為兩個種的界限逐漸模糊。

由于這兩個種親緣關(guān)系很近，又經(jīng)常在病木中同時存在，兩個種能否雜交一直受到關(guān)注。深入研究這一問題，不僅有助于傘滑刃屬線蟲分類學研究，并且在松萎蔫病的流行和檢疫等方面有重要的價值。

本研究在實驗室條件下開展了松材線蟲與擬松材線蟲雜交及后代繁殖力研究，并在此基礎上探討了松材線蟲和擬松材線蟲在自然界是否具備雜交潛力。

1材料與方法

1.1供試線蟲來源

蟲株來源及編號見表1，各蟲株都經(jīng)過形態(tài)學和特異引物擴增詳細鑒定，在分類上確認無誤。

1.2PDA平板-灰葡萄孢培養(yǎng)

線蟲的繼代培養(yǎng)采用灰葡萄孢Botrytis cinerea作為線蟲食料。將少量灰葡萄孢菌絲塊接種至滅菌PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 ml）平板上，再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使皿底向上，置于25 ℃恒溫箱中。培養(yǎng)5～7 d后菌絲長滿后放置4 ℃冰箱備用。

1.3未受孕雌線蟲準備

將在灰葡萄孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)的線蟲用無菌水洗出，在體視顯微鏡下用挑針挑取單條大齡幼蟲。顯微鏡下（×40）鏡檢鑒別雄蟲和雌蟲（雌蟲陰門尚未分化，在體長約2/3處可見白色區(qū)域，雄蟲則直接挑出），將雌蟲放入裝有2 ml無菌水的無菌微型培養(yǎng)皿中。挑入1～2根灰葡萄孢菌絲（飼喂線蟲），25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，待線蟲長成成蟲備用。

1.4松材線蟲與擬松材線蟲雜交測定

將培養(yǎng)好的單條未受孕雌成蟲和3條異種雄成蟲（正交母本為松材線蟲，父本為擬松材線蟲）挑入盛有灰葡萄孢菌絲塊的培養(yǎng)皿（直徑3 cm）中，讓其在灰葡萄孢菌絲塊上交配并繁殖；同時做反交交配組合（母本為擬松材線蟲，父本為松材線蟲）；以松材線蟲、擬松材線蟲的種內(nèi)交配為對照。每個組合重復15次。25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，7 d后，用無菌水洗下培養(yǎng)皿中的所有線蟲，在體視顯微鏡下逐一檢查是否有雜交后代產(chǎn)生并統(tǒng)計雜交后代的數(shù)量，計算每個組合的交配率、平均后代數(shù)、性比和死亡率。

交配率（%）=（產(chǎn)生后代培養(yǎng)皿數(shù)/ 重復培養(yǎng)皿數(shù)）× 100%

平均后代數(shù)=產(chǎn)生后代的培養(yǎng)皿內(nèi)的線蟲數(shù)量總和/產(chǎn)生后代的培養(yǎng)皿數(shù)

死亡率（%）=（死亡總蟲數(shù)/后代總蟲數(shù)） ×100%

1.5雜交后代繁殖力測定

為進一步了解各雜交后代的繁殖能力，對ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm組合的正反交后代進行繼代培養(yǎng)，測定每代的交配率、性比、死亡率等，以ZJBx、FrBm和CBm的種內(nèi)交配繼代培養(yǎng)作為對照。取F1代培養(yǎng)好的1條未受孕雌蟲和1條活躍雄蟲繼續(xù)在盛有灰葡萄孢菌絲塊的培養(yǎng)皿（直徑3 cm）中培養(yǎng)，做正交和反交組合，并以同種內(nèi)交配產(chǎn)生的F1代作為對照，每個組合重復15次。25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，7 d后，用無菌水洗出各培養(yǎng)皿中的F2代，在體視顯微鏡下逐一檢查是否有后代產(chǎn)生并統(tǒng)計后代數(shù)量，計算每個組合的交配率、平均后代數(shù)、性比和死亡率。雜交出的每一代（每隔7 d）都按此方法進行雜交和統(tǒng)計，直至雜交出來F5代。

1.6雜交后代同親本回交能力測定

為了解雜交后代同親本的回交能力，把ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm組合的正反交后代（F1、F2）與親本進行回交。挑取F1、F2代單條未受孕雌成蟲和3條親本雄蟲挑入盛有灰葡萄孢菌絲塊的培養(yǎng)皿（直徑3 cm）中，讓其在灰葡萄孢菌絲塊上交配并繁殖。每個組合重復15次。25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，7 d后，用無菌水洗出各培養(yǎng)皿中的所有線蟲，在體視顯微鏡下逐一檢查是否有后代產(chǎn)生并統(tǒng)計后代數(shù)量，計算每個組合的交配率、平均后代數(shù)、性比和死亡率。

2結(jié)果與分析

2.1松材線蟲和擬松材線蟲雜交結(jié)果

分別對來自浙江和馬鞍山的松材線蟲株系和來自中國、法國的擬松材線蟲株系進行種間雜交和種內(nèi)交配，培養(yǎng)7 d后觀察其F1代產(chǎn)生情況（見表2）。結(jié)果表明，供試的4個雜交組合（無論是正交還是反交）均有后代產(chǎn)生，交配率在133%～467%之間，每個組合平均后代數(shù)為11～47，F(xiàn)1代死亡率為158%～282%。不同雜交組合交配率、平均后代數(shù)和死亡率有所差異，中國浙江松材線蟲株系（ZJBx）和法國擬松材線蟲株系（FrBm）雜交組合交配率、平均后代數(shù)較高，且死亡率偏低；中國馬鞍山松材線蟲株系（MASBx）和法國擬松材線蟲株系（FrBm）雜交組合交配率、平均后代數(shù)較低；其余組合交配率、平均后代數(shù)位于二者之間。同一雜交組合內(nèi)，正交與反交的交配率、平均后代數(shù)和死亡率有所差異，總體上以擬松材線蟲為母本的反交組合的交配率、平均后代數(shù)稍高于正交組合。種內(nèi)交配的所有組合，交配率、平均后代數(shù)都遠高于雜交組合，且后代死亡率較低。交配率在600%～100%之間，每個組合平均后代數(shù)為117～131，F(xiàn)1代死亡率為90%～168%。

由此可知，盡管與種內(nèi)交配相比，供試雜交組合交配率和平均后代數(shù)偏低，且F1代死亡率稍高，但在實驗室條件下松材線蟲和擬松材線蟲可以成功雜交，且雜交后代可以存活。

2.2雜交后代繁殖能力

供試的兩個雜交組合（無論正交還是反交）F2至F5代繁殖能力均較強（見表3）。ZJBx×FrBm組合F2至F5代交配率在400%～800%之間，每對產(chǎn)生的平均后代數(shù)在27～51之間，后代死亡率為163%～221%。ZJBx×CBm組合F2至F5代交配率、平均后代數(shù)稍高，分別為467%～800%和50%～68%，后代死亡率為135%～255%。

與對照ZJBx、FrBm種內(nèi)交配相比較，2個種種內(nèi)交配F2至F5代交配率均高于兩個雜交組合， ZJBx種內(nèi)交配F2至F5代平均后代數(shù)高于兩個雜交組合，死亡率相當，而FrBm種內(nèi)交配F2至F5代平均后代數(shù)與ZJBx×FrBm組合相當，稍低于ZJBx×CBm組合，死亡率相當。

根據(jù)本試驗結(jié)果，供試松材線蟲與擬松材線蟲蟲株不僅在實驗室條件下可以雜交，而且雜交產(chǎn)生的后代繁殖能力較強，F(xiàn)2至F5代交配率、平均后代數(shù)等均較高，后代死亡率較低。

2.3雜交后代同親本回交能力

結(jié)果如表4所示，ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm組合的雜交后代（F1、F2）都可以和親本回交，交配率在在167%～667%之間，產(chǎn)生的平均后代數(shù)在10～35之間，后代死亡率為126%～563%。總體上來說，同一個組合內(nèi)，F(xiàn)1代同親本回交的交配率和平均后代數(shù)稍高于F2代，后代死亡率相當。F1（ZJBX♀×CBm♂）×ZJBX♂、F2（ZJBX♀×CBm♂）×ZJBX♂回交組合回交后代數(shù)量較少，其死亡率較高，這可能是導致回交后代雌雄比例不合理的原因，從而可以推測回交后代繼續(xù)繁殖的可能性會降低，但是ZJBX♀×CBm♂、ZJBX♀×CBm♂F1、F2代同父本擬松材線蟲CBm回交的交配率、平均后代數(shù)和死亡率都和其它組合相當。其它組合也表現(xiàn)出該特征，即F1、F2代更易和擬松材線蟲回交。

由本試驗結(jié)果可知，松材線蟲與擬松材線蟲雜交后代可以和親本回交，F(xiàn)1代同親本回交的交配率和平均后代數(shù)稍高于F2代，后代死亡率相當。F1、F2代更易和擬松材線蟲回交。

3討論

學術(shù)界關(guān)于松材線蟲和擬松材線蟲能否雜交及雜交后代能否存活一直存在爭議，不同研究者所得出的結(jié)論各不相同。最早Mamiya用日本的3個松材線蟲蟲株和8個擬松材線蟲蟲株開展雜交研究，結(jié)果各組合均能產(chǎn)生F1代，但F1代都不能繁育F2代，也不能與親本回交，因此認為松材線蟲和擬松材線蟲種間存在明顯的生殖隔離[5]。這一研究結(jié)論不久就受到質(zhì)疑。Hajaukiewicz用一個日本松材線蟲株系與法國擬松材線蟲株系進行雜交，發(fā)現(xiàn)二者具有很高的雜交潛力，雜交后代可以產(chǎn)生多代，且繁殖能力很強[6]。Bolla等收集了北美、日本和法國松材線蟲與擬松材線蟲蟲株，其中不少蟲株可以雜交，且F1代可繁育F2等后代[7]。Braasch用德國擬松材線蟲株系與日本松材線蟲株系雜交，二者能雜交并產(chǎn)生有致病能力的后代[8]。Riga認為松材線蟲和擬松材線蟲未發(fā)展出生殖隔離，在實驗室條件下可成功雜交，但自然界二者不存在基因交流[9]。劉偉等研究表明有部分雜交組合產(chǎn)生了F2、F3等后代，通過回交也得到了可繁殖的后代，但后代數(shù)量少，認為自然界存在雜交種的可能性不大[10]。季宏鐵的研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)的松材線蟲和擬松材線蟲雜交產(chǎn)生的后代在一代或多代之后就不可再繁殖，只有法國擬松材線蟲和北美松材線蟲雜交才可以產(chǎn)生可育的后代[11]。賁愛玲等研究發(fā)現(xiàn)不同國家的松材線蟲均能和擬松材線蟲發(fā)生雜交且雜交率較高，但雜交后代較難成活[12]?？v觀前人研究結(jié)果，除了Mamiya認為二者絕對不能雜交以外，其他研究盡管采用的蟲株和雜交方法有所差異，但均在實驗室條件下培育出了可繁育的后代。本研究中多個雜交組合均能雜交或回交成功，產(chǎn)生的后代大部分存活較好。

在松材線蟲傳入中國之前，沒有擬松材線蟲大面積致病的報道，早期研究亦認為，擬松材線蟲不具致病性或致病性非常弱，只在松樹受到惡劣環(huán)境影響或其他有害因子的危害造成松樹樹勢衰弱時，起到加速松樹枯死的作用。近幾年來不斷有強致病性擬松材線蟲蟲株報道出現(xiàn)并且中國有很多地區(qū)都發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲致使成片松林枯死。這些現(xiàn)象引起了筆者的關(guān)注，是否自然界存在著松材線蟲與擬松材線蟲的基因交流，從而導致擬松材線蟲致病性增強。

從本研究結(jié)果來看，母本為擬松材線蟲、父本為松材線蟲的條件下種間雜交和后代數(shù)量更高。而F1、F2更容易和擬松材線蟲進行回交，這表明松材線蟲的基因滲入擬松材線蟲更加容易，與Taga等人的研究結(jié)果較為一致[13]。這一結(jié)論似乎能一定程度上闡釋擬松材線蟲的致病性增強現(xiàn)象與松材線蟲入侵后二者基因交流有關(guān)系，因此不能完全否定自然界存在著松材線蟲與擬松材線蟲的基因交流，今后仍需要加強相關(guān)研究。

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（責任編輯：夏劍萍）