草魚凝集素分子的基因克隆與進化分析

米亞雙++程傳波

草魚是我國重要的養(yǎng)殖淡水魚，其產(chǎn)量以及產(chǎn)值居于魚類養(yǎng)殖業(yè)的前列。凝集素是一類具有糖結(jié)合專一性，并與之非共價可逆結(jié)合的非酶、非免疫來源的蛋白質(zhì)，其中把活性依賴于Ca2+者稱為C型凝集素。C型凝集素都具有一個或多個糖結(jié)構(gòu)識別域（Carbohydrate-recognition domain，CRD）。魚類中所存在的天然凝集素分子在其非特異性免疫中占據(jù)重要地位，是魚類抵御異己物質(zhì)入侵的一道防線。

材料與方法

材料。在超市購買健康的草魚，體長大約為30cm，體重為1.47kg。

方法。（1）草魚凝集素基因的克?。簭牟蒴~組織中提取草魚RNA，并通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得草魚凝集素基因。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以草魚的cDNA為模板，根據(jù)已設(shè)計好的引物，運用PCR技術(shù)獲得草魚凝集素基因。根據(jù)草魚凝集素的保守CRD設(shè)計引物，CILECF：ATGGAAGATATTGAAAATTACACCA，CILECR：GATATCATGTTAAGTGTGTGATAGGATCCATCTC。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；56℃退火40s；72℃延伸40s；25個循環(huán)，72℃延伸10min。最后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。（2）TA克隆：將PCR產(chǎn)物與pEASY-T1Simple vector載體連接。鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑單克隆進行菌落PCR鑒定。將鑒定的陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。（3）構(gòu)建進化樹：在GenBank中查找不同物種C型凝集素，下載其氨基酸序列。利用SMART對各物種凝集素的二級結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)域進行了初步分析。用Clustalx軟件對所選物種的凝集素CRD的氨基酸序列進行多重序列比對。再結(jié)合分子生物學(xué)分析軟件MEGA4.0將比對結(jié)果以鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

結(jié)果

草魚凝集素基因克隆結(jié)果。實驗結(jié)果顯示在草魚肝和腸組織中擴增出800bp左右的片段，與預(yù)期一致。

草魚凝集素基因全長序列分析。用生物信息學(xué)在線分析軟件對草魚凝集素基因的測序結(jié)果進行分析（如圖1），草魚凝集素基因的開放閱讀框的長度為為795bp，編碼一個由264個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為29868.1，等電點為5.03，46～68aa為跨膜區(qū)，125～256aa為CRD。氨基酸序列上的第125、136、153、232、247、255位置上含有6個高度保守的半胱氨酸殘基（三角內(nèi)），并且該凝集素只有一個CRD（下劃線部分）。氨基酸序列還含有一個結(jié)合甘露糖的糖識別結(jié)合位點即EPN基序（橢圓內(nèi)）和一個作為C型凝集素重要標志的WIGL序列（矩形內(nèi)）。

草魚凝集素的系統(tǒng)進化分析。用生物信息學(xué)MEGA4.0以鄰接法（NJ法）構(gòu)建草魚，斑馬魚，鯽魚，雀鱔，原雞，家鼠，牛，人等C型凝集素蛋白的系統(tǒng)進化樹。從圖2可以看出系統(tǒng)進化樹分為三大支，草魚同斑馬魚，鯽魚，雀鱔，白斑狗魚，虹鱒，大西洋鮭進化關(guān)系較近，處于一支，說明C型凝集素在進化過程中，草魚同硬骨魚的親緣關(guān)系較近，其中與斑馬魚的關(guān)系最近。

草魚凝集素基因的同源性分析。用DNAMAN對所選物種凝集素的CRD進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，草魚凝集素CRD與斑馬魚凝集素CRD的相似度達到90%，同鯽魚、雀鱔、大西洋鮭和虹鱒的相似度分別達到83%、63%、53%和51%。序列比對結(jié)果進一步驗證了在草魚的CRD中存在6個保守的半胱氨酸（用箭頭標出）殘基和一個甘露糖結(jié)合位點EPN基序（用棱形標出），并且在這幾種硬骨魚凝集素的CRD中均存在WIGL序列。由此可以看出，草魚凝集素的CRD與斑馬魚的同源性最高。

討論

本研究用Trizol法從草魚組織中提取RNA，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得草魚凝集素基因的開放閱讀框的長度為795bp，編碼了一個由264個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，用SMART對該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)草魚凝集素蛋白是由一個跨膜區(qū)（46～68aa）和一個CRD（125～256aa）組成，且CRD位于該蛋白的C端，含有六個保守的半胱氨酸殘基，由此可以判定草魚凝集素的CRD屬于標準長型CRD。從其序列分析來看，在草魚凝集素的CRD上存在一個WIGL基序和甘露糖結(jié)合位點即EPN基序，因此可以確定該凝集素是一種C型凝集素。同源性分析表明，草魚與斑馬魚的相似度最高，達到90%。從系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明草魚凝集素與斑馬魚的親緣關(guān)系最近?？衫靡勋@得的草魚凝集素基因作為重組表達的基礎(chǔ)，用真核表達系統(tǒng)進行表達純化，研究其蛋白質(zhì)的組成及功能，研發(fā)出新型的病害治療藥物，應(yīng)用于草魚的免疫和病害防御上，實現(xiàn)健康、可持續(xù)的養(yǎng)殖。

作者簡介：

米亞雙（1991-），女，河南南陽人，河南師范大學(xué)在讀研究生。