熱休克蛋白90調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)c-Jun的穩(wěn)定性

蘆 博，劉功儉，齊敦益

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 徐州 221002）

熱休克蛋白90調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)c-Jun的穩(wěn)定性

蘆 博，劉功儉，齊敦益

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 徐州 221002）

目的 觀察熱休克蛋白90調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注損傷后海馬CA1區(qū)c-Jun的穩(wěn)定性。方法 免疫印跡法觀察不同處理組c-Jun蛋白的表達(dá)變化，免疫沉淀法檢測Hsp90與c-Jun的關(guān)系以及c-Jun泛素化水平的變化，焦油紫染色研究海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失。結(jié)果 1.在腦缺血再灌注后c-Jun與Hsp90形式免疫復(fù)合物。2.給予GA后c-Jun表達(dá)與I/R6h組比較有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論 GA通過抑制hsp90的分子伴侶活性，使其客戶蛋白c-Jun穩(wěn)定性降低發(fā)生經(jīng)由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而產(chǎn)生減少海馬神經(jīng)元遲發(fā)型死亡的作用。

熱休克蛋白90；腦缺血再灌注；c-Jun

目前普遍認(rèn)為熱休克蛋白90（heatshockprotein90，Hsp90）是一種重要的分子伴侶蛋白，在和多種客戶蛋白協(xié)同作用下，可以將其正常的功能充分發(fā)揮。我室研究表明，Hsp90參與了腦缺血有關(guān)的病理及生理過程[1]。但并沒有闡明其作用的分子機制。c-Jun蛋白是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族的組成成員，在腦缺血再灌注損傷后可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。格爾德霉素（Geldanamycin，GA）能夠競爭性的結(jié)合到Hsp90的N-末端ATP/ADP結(jié)合域，導(dǎo)致其客戶蛋白的降解。有文獻(xiàn)報道GA可以通過抑制Hsp90的分子伴侶活性降低HEK293細(xì)胞中c-Jun蛋白水平[2]。卻沒有檢測出細(xì)胞中內(nèi)源性HSP90與內(nèi)源性c-Jun的相互結(jié)合。本實驗擬通過全腦缺血/再灌注的大鼠模型，研究Hsp90與c-Jun的關(guān)系，以期待通過給以GA來抑制c-Jun在腦缺血再灌注損傷后可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

此研究中使用的大鼠體重均在250～300 g。GA購于美國MDBio公司，抗體（anti-c-Jun，anti-p-c-Jun，antiubiquitin和anti-Hsp90）由SantaCruz公司提供；二抗（羊抗兔），

1.2 大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型

依據(jù)參照大鼠四動脈結(jié)扎模型將本次研究的動物模型進(jìn)行制備[3]，隨后對動物進(jìn)行麻醉的注射，將雙側(cè)頸總動脈進(jìn)行分離，椎動脈予以電凝操作。

1.3 動物的分組及處理措施

假手術(shù)組（Sham組）分離雙側(cè)頸總動脈，電凝椎動脈但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈；缺血/再灌注組（I/R組）；給藥組，缺血前20 min經(jīng)側(cè)腦室注射800μM的GA10 μL，或者側(cè)腦室注射0.16 mg/kg體重的MG1325 μL和1600μM的GA5 μL混合液，然后缺血15 min；溶劑對照組同樣方法注射等體積的溶劑（20%DMSO）。

1.4 樣品的制備

首先對蛋白測定樣品實施再灌注，超過6小時后處死大鼠，并取其腦部，并將雙側(cè)海馬進(jìn)行分離。海馬于液氮中提取，同時將勻漿緩沖液加入其中，離心后將上層清液去除，將0.5 mL勻漿緩沖液A加入沉淀中，隨后再次進(jìn)行離心，將上層清液去除，將0.5 mL勻漿緩沖液B。最后放置在適宜條件下儲存。

1.5 檢測方法

蛋白含量測定方法依據(jù)BCA方法進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的參考依據(jù)牛血清白蛋白為準(zhǔn)。

免疫沉淀與免疫印跡若蛋白類含量相同，均為400 μg，需將IP緩沖液加入其中，以20 μL蛋白A預(yù)吸附1 h，10000 g離心2 min，選取上冊清液后將抗加入其中，量為1～2 μg，將其放在旋轉(zhuǎn)混勻器上，反應(yīng)時間為4小時，隨后將20 μL蛋白A加入其中，將其放置在旋轉(zhuǎn)混勻器上，進(jìn)行2小時的反應(yīng)。將其進(jìn)行離心操作，并對其沉淀進(jìn)行沖洗三次，利用IP緩沖液洗。待上述操作完成后將蛋白上樣緩沖液加入其中，將其混勻后放置在適宜條件下，即沸水浴，時間為5分鐘，1000 g離心2 min，取上清用于免疫印跡。參考Sambrook等方法，含相同蛋白量的樣品或者IP處理后樣品，經(jīng)SDSPAGE分離后，將其在PVDF膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)移，利用干轉(zhuǎn)法進(jìn)行。在封閉液中放置PVDF，并在溫室條件下進(jìn)行孵育，時間達(dá)到3小時后將一抗工作液加入其中。加入HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育半小時，TBST洗膜（3 min×5），水洗。使用ECLPlus試劑盒，暗室曝光，顯影定影。掃描膠片上條帶，圖像處理儀分析免疫印跡的灰度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件SigmaStat 3.2處理，以±S.D.表示，采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 c-Jun是Hsp90的客戶蛋白

我們用hsp90的抗體（A）或者c-Jun的抗體（B）做免疫沉淀，得到的條帶再用c-Jun的抗體和Hsp90的抗體做免疫印跡分析。兩組結(jié)果如圖1顯示I/R6h組c-Jun和Hsp90形成免疫復(fù)合物，給藥組（GA）可抑制免疫復(fù)合物的表達(dá)。這表明c-Jun是Hsp90的客戶蛋白之一，二者在缺血再灌注損傷中形成免疫復(fù)合物。

圖1 免疫沉淀分析海馬CA1區(qū)的核提取物，用Hsp90的抗體做免疫沉淀，再用c-Jun的抗體做免疫印記分析（A），用c-Jun的抗體做免疫沉淀，再用Hsp90的抗體做免疫印記分析（B）

2.2 Hsp90的抑制劑GA抑制c-Jun的蛋白表達(dá)

缺血前20 min經(jīng)側(cè)腦室注射800μM的GA10 μL，然后缺血15 min，再灌注6 h。核提取物免疫印跡法分析，結(jié)果如圖2顯示I/R6 h組較Sham組，c-Jun表達(dá)顯著增加（aP＜0.05）；給藥組（GA）較I/R6 h組，c-Jun表達(dá)顯著降低（bP＜0.05）。這說明GA可以抑制由缺血再灌注引起的c-Jun表達(dá)。

圖2 免疫印跡法分析得到Sham組、I/R6h組、給藥組（GA）和溶劑對照組（DMSO）的海馬CA1區(qū)c-Jun的蛋白表達(dá)條帶（A）及掃描圖（B）（n=4）aP＜0.05versusSham；bP＜0.05versusR6hgroups

2.3 MG132阻斷GA促進(jìn)的泛素化依賴的c-Jun的降解

缺血前20 min側(cè)腦室注射各5 μLMG132（40 μg/10 μL）GA（1600μM）的混合液和800 μM的GA10 μL，缺血15 min，再灌注3 h。結(jié)果如圖3A顯示由GA造成的c-Jun表達(dá)減低可被MG132完全阻斷。這一結(jié)果提示c-Jun的降解經(jīng)由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，于是我們用免疫沉淀的方法檢測MG132作用后c-Jun的相對泛素化水平。結(jié)果如圖3B顯示，在MG132與GA共同存在下，c-Jun的泛素化水平降低。這說明GA引起的c-Jun表達(dá)降低通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，而MG132可以阻斷這種降解。

圖3 （A）免疫印跡分析海馬CA1區(qū)，MG132阻斷GA促進(jìn)的c-Jun表降解。（B）免疫沉淀法分析，MG132抑制c-Jun經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。（n=4）。aP＜0.05versussham；bP＜0.05versusR6hgroup；cP＜0.05versusGAgroup

2.4 GA具有抗神經(jīng)元遲發(fā)型死亡作用

缺血再灌注損傷可引起海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞的遲發(fā)型死亡，如圖4焦油紫染色結(jié)果顯示，在Sham組（圖4a、b），正常的椎體細(xì)胞顯示出圓形淡著色的細(xì)胞核，而在R5d組（圖4c、d）、G132+GA組（圖4g、h）和DMSO組（圖4i、j），死細(xì)胞呈現(xiàn)出固縮的細(xì)胞核。I/R的損傷作用可被GA（圖4e、f）逆轉(zhuǎn)。綜上所述，GA具有抗I/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元遲發(fā)型死亡的作用。

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（焦油紫染色）a、c、e、g、i：x40；b、d、f、h、j：x400。比例尺200 μm（i）和10 μm（j）。在1mm的面積內(nèi)計數(shù)活細(xì)胞個數(shù)。aP＜0.05versustheShamgroup；bP＜0.05versustheR5dgroup，n=6)

3 討 論

在真核生物細(xì)胞中，熱休克蛋白90較為常見，且該物質(zhì)中的胞質(zhì)蛋白較為豐富。與此同時，熱休克蛋白90可以在分子伴侶中直接參與，隨后調(diào)節(jié)新生客戶蛋白的折疊，另外還可以調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性和活性[1、3]。以上蛋白會由多伴侶復(fù)合物進(jìn)行釋放，最終致使客戶蛋白被降解，從而對細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控有著不利影響，甚至?xí)π盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)有著嚴(yán)重影響[4]。

我們的研究結(jié)果都支持的觀點c-Jun的是HSP90的客戶蛋白（圖1所示），通過給予GA抑制Hsp90的分子伴侶活性，從而使c-Jun的蛋白表達(dá)降低（圖2所示）。

蛋白酶體與泛素化信號系統(tǒng)一起構(gòu)成的泛素一蛋白酶體通路是真核生物細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)選擇性降解途徑，其不僅在多種調(diào)控蛋白質(zhì)加工和更新過程中直接參與，同時對細(xì)胞的增值、分化以及凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，除此之外，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動過程，如：中細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及應(yīng)激反應(yīng)。

我們的研究結(jié)果表明，c-Jun的降解主要是通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)。根據(jù)我們目前的結(jié)果（圖3），在MG132存在的條件下，c-Jun蛋白表達(dá)明顯增加。在應(yīng)用疫沉淀的方法檢測MG132作用后c-Jun的相對泛素化水平，我們選擇了再灌注時間是3小時，而不是6小時，是因為再灌注6 h后，通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的c-Jun降解已經(jīng)減少，所以其水平難以測得，而在再灌注3 h后，c-Jun的降解主要由泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)，其水平易于測得。根據(jù)我們目前得到的結(jié)果，不可否認(rèn)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)c-Jun的降解，但并不是唯一的，也不可排除其他的降解途徑。

c-Jun蛋白是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族的組成成員，在腦缺血再灌注損傷后可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。前面的實驗結(jié)果顯示GA可以抑制c-Jun蛋白表達(dá)，通過焦油紫染色的結(jié)果（圖4），給予GA可提高海馬神經(jīng)元存活細(xì)胞的數(shù)量，故其具有抗c-Jun誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元遲發(fā)型死亡作用。

[1] Yong-LingXu,C.Li,andGuang-YiZhang.ChinJNeurosci, 2003,19:74-78.

[2] FranciscoH.Cruzalegui,GilesE.HardinghamandHilmarBading. EMBOJournal,2009,18:1335-1344.

[3] YanXia,JiWang,andW.K.AlfredYung.MolecularCell, 2007,25:219-232.

[4] HironobuIguchi,TetsuoMitsui,MahoIshida.ShigenobuKanbaand JunArita.ndocrineJournal,2011,58:747-759.

[5] Acosta-SaltosA.,MakwanaM.andRaivichG.Soc. Neurosci,2007:136.

[6] KunlinJin,XiaoOuMao,RogerP.Simon,andDavidA.Greenberg.Jour nalofMolecularNeuroscience,2001,16:49-56.

本文編輯：吳玲麗

R749

B

ISSN.2095-8242.2017.32.6153.03