豬沙門氏菌耐藥基因檢測(cè)方法應(yīng)用分析

余超亞

摘要：沙門氏菌是一種重要的人畜共患病的病原菌，其分布廣，危害大。而隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性也隨之出現(xiàn)，耐藥的水平越來(lái)越高，耐藥種類越來(lái)越多。本文則針對(duì)豬沙門氏菌病的流行現(xiàn)狀及危害，病原菌的耐藥現(xiàn)狀、耐藥機(jī)理、耐藥性的基因檢測(cè)方法、防范對(duì)策進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：豬；沙門氏菌；耐藥機(jī)理；基因檢測(cè)

在抗菌藥物的不斷普及以及廣泛使用下，細(xì)菌逐漸呈現(xiàn)出耐藥性。特別對(duì)于畜牧養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)，為對(duì)疾病感染做出避免，使動(dòng)物健康成長(zhǎng)，越來(lái)越多的飼養(yǎng)人員將抗生素作為飼料添加劑來(lái)進(jìn)行使用，因劑量不足以及藥物殘留使得耐藥菌株大量出現(xiàn)。一直以來(lái)，各國(guó)學(xué)者針對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)理實(shí)施了詳細(xì)的探討，取得了一定的成績(jī)，尤其在分子生物學(xué)以及基因工程技術(shù)的不斷快速發(fā)展下，細(xì)菌耐藥機(jī)理實(shí)現(xiàn)了更深入的研究，本文則基于此對(duì)豬沙門氏菌耐藥基因檢測(cè)方法應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的分析。

一、豬沙門氏菌病的流行現(xiàn)狀與危害

豬沙門氏菌會(huì)導(dǎo)致仔豬副傷寒，急性病例可能會(huì)引發(fā)敗血癥變化，有著極高的死亡率。慢性病例則可能會(huì)引發(fā)壞死性腸炎，對(duì)豬的正常生長(zhǎng)造成不利影響。豬沙門氏菌極易引發(fā)2-4月齡仔豬副傷寒，屬于養(yǎng)殖業(yè)面臨的一大難題。急性敗血癥、慢性壞死性腸炎以及頑固性下痢等屬于仔豬副傷寒（簡(jiǎn)稱仔副）的臨床癥狀，會(huì)導(dǎo)致大量的斷奶仔豬同時(shí)發(fā)病，在并發(fā)感染其它疾病以及未及時(shí)治療的情況下，有著極高的死亡率，使得養(yǎng)殖戶出現(xiàn)很大的損失。該病隨時(shí)有可能發(fā)生，通常都是和豬瘟同時(shí)出現(xiàn)，使得發(fā)病率以及死亡率出現(xiàn)了很大的增長(zhǎng)。

二、病原菌的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)理

（一）病原菌的耐藥現(xiàn)狀

馬越針對(duì)分離的沙門氏菌在耐藥性變化方面實(shí)施了詳細(xì)的研究探討，得知非傷寒沙門氏菌在兩年的時(shí)間里，對(duì)于臨床常用抗菌藥所具備的耐藥率持續(xù)上升，自20.0%增長(zhǎng)到了31.5%，一直增長(zhǎng)至50.0%-59.3%，在耐藥率方面出現(xiàn)了一倍左右的增長(zhǎng)。基于國(guó)外相關(guān)調(diào)查能夠得知，非傷寒沙門菌以及大腸桿菌對(duì)于臨床常用抗菌藥存在一定的耐藥性，同時(shí)耐藥率還處于不斷增加的趨勢(shì)，可以對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的菌株數(shù)量也不斷增加。通過(guò)CDC的資料能夠得知，對(duì)于耐氨節(jié)西林，氯霉素，鏈霉素，磺胺以及四環(huán)素的鼠傷寒沙門菌，其從1979年占據(jù)美國(guó)鼠傷寒沙門菌分離株比重的l%以下朝1996年占據(jù)34%的比重進(jìn)行了增長(zhǎng)。最近幾年，沙門氏菌多重耐藥菌株持續(xù)導(dǎo)致人和動(dòng)物出現(xiàn)疾病，對(duì)于公眾健康有著極大的不利影響，使得世界各國(guó)對(duì)其做出了重視。

（二）病原菌的耐藥機(jī)理

1.細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)理

當(dāng)前，比較常見(jiàn)的氨基糖苷類抗生素耐藥機(jī)理主要包含有以下幾種：其一，細(xì)菌之所以對(duì)氨基糖苷類抗生素存在抗性主要是因?yàn)樗幬餆o(wú)法在細(xì)菌胞內(nèi)形成一定程度的濃度。細(xì)菌便是基于該機(jī)制而對(duì)慶大霉素存在耐藥性的。其二，處于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的變化核糖體屬于氨基糖苷類抗生素的主要作用點(diǎn)，在核糖體蛋白以及16SrRNA出現(xiàn)突變的情況下，16SrRNA甲基化修飾等會(huì)使得細(xì)菌出現(xiàn)一定的耐藥性。其三，細(xì)菌之所以可以對(duì)氨基糖苷類抗生素做出抵抗主要是由于細(xì)菌可以對(duì)氨基糖苷類抗生素鈍化酶做出構(gòu)成，該類酶共價(jià)對(duì)抗生素特定氨基以及氨基功能團(tuán)起到修飾作用，抗生素以及核糖體氨酰-tRNA在被修飾之后，親和力便會(huì)出現(xiàn)很大程度的減少，無(wú)法對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)在合成方面做出有效阻止，使得細(xì)菌對(duì)抗生素出現(xiàn)抵抗能力。

2.細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥機(jī)理

通常情況下，四環(huán)素之所以存在耐藥性主要是因?yàn)榫邆浜徒雍腺|(zhì)粒以及轉(zhuǎn)座子相關(guān)的新四環(huán)素耐藥基因tet（又叫做四環(huán)素抗性決定子）。tet基因編碼胞質(zhì)（漿）膜蛋白Tet（又叫做Tet逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），屬于質(zhì)子動(dòng)力依賴性蛋白的一種。Tet膜蛋白介導(dǎo)在耐藥機(jī)制方面主要涉及到以下幾個(gè)方面：能量依賴性泵出機(jī)制（又叫做主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制）、核糖體保護(hù)機(jī)制以及四環(huán)素鈍化酶機(jī)制。和核糖體保護(hù)機(jī)制存在關(guān)聯(lián)的耐藥基因主要包含有tet（M），tet（O），tet（S），tet（W），tet（Q），tet（T），otr（A）以及tetP（B）等這幾種。和酶鈍化機(jī)制存在關(guān)聯(lián)的耐藥基因主要包含有tetX編碼蛋白，其屬于氧化還原酶的一種，基于化學(xué)修飾四環(huán)素來(lái)讓四環(huán)素不再具備活性。

3.細(xì)菌對(duì)磺胺類抗生素的耐藥機(jī)理

當(dāng)前，在革蘭氏陰性腸道菌中，已發(fā)現(xiàn)對(duì)磺胺類藥物存在抗性的兩種二氫葉酸合成酶，Sul I，Sul II以及Sul III分別為其基因命名。相比大腸桿菌以及其它細(xì)菌中所包含的二氫葉酸合成酶基因（dhps）來(lái)說(shuō)，Sul I，Sul II在保守序列方面存在很大的不同。而對(duì)于Sul III，對(duì)其的研究和探討時(shí)間不長(zhǎng)。2002年，Vincent等在對(duì)大腸桿菌的PV0440質(zhì)粒進(jìn)行研究的過(guò)程中，得知在質(zhì)粒上存在一種功能和二氫葉酸合成酶十分相似的蛋白質(zhì)，相當(dāng)于263個(gè)氨基酸的大小。其表達(dá)基因Sul III可以讓大腸桿菌對(duì)磺胺類藥具備一定的抗性。

細(xì)菌之所以極易對(duì)磺胺類藥物出現(xiàn)耐藥性，主要是由于細(xì)菌中具備大量的PABA、二氫葉酸合成酶在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)了更改以及對(duì)外源性葉酸進(jìn)行了直接形式的使用。每種磺胺類藥相互之間都會(huì)出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象。

4.細(xì)菌對(duì)氯霉素類抗生素的耐藥機(jī)理

一般情況下，酶的滅活機(jī)制細(xì)菌之所以對(duì)氯霉素以及甲砜霉素存在抗性主要是因?yàn)橐阴；D(zhuǎn)移酶對(duì)氯霉素以及甲砜霉素存在一定的鈍化作用。黃瑞等針對(duì)傷寒沙門氏菌在耐藥性方面實(shí)施了長(zhǎng)期的研究，基于質(zhì)粒的消除以及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)得知，該質(zhì)粒是使得傷寒沙門氏菌具備耐藥性的關(guān)鍵因子。孫憲鋒以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性（CAT）以及藥敏試驗(yàn)（MIC）為基礎(chǔ)，基于Slot blot以及Southern blot法對(duì)沙門菌耐藥基因在位置方面實(shí)施檢測(cè)，最終得知，大多數(shù)（10/16）傷寒菌耐氯霉素基因都存在于質(zhì)粒上，還有一小部分（1/16）則存在于染色體（3/16）上。

三、耐藥性的基因檢測(cè)方法

（一）藥敏試驗(yàn)

主要包含有兩種方面，分別為稀釋法以及擴(kuò)散法。稀釋法主要是基于大腸桿菌ATCC25922以及沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株C79213來(lái)充當(dāng)作藥敏質(zhì)控菌，通過(guò)對(duì)具備一定濃度的抗菌藥物以及含有被試豬沙門氏菌的培養(yǎng)基做出運(yùn)用來(lái)完成倍數(shù)上存在差異的稀釋，通過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，對(duì)最低抑菌濃度（MIC）做出觀察；擴(kuò)散法主要指的是將浸有抗菌藥物的紙片朝涂有豬沙門氏菌的瓊脂平板上進(jìn)行粘貼，抗菌藥物不斷向周圍彌漫，濃度隨著時(shí)間的推移慢慢減少，所以敏感豬沙門氏菌通常在紙片距離內(nèi)會(huì)難以實(shí)現(xiàn)快速增長(zhǎng)，基于稀釋試驗(yàn)所獲取的MIC對(duì)數(shù)和基于擴(kuò)散試驗(yàn)所獲取的抑菌直徑之間存在著一種直線關(guān)系。

（二）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

這屬于對(duì)熒光染料做出使用來(lái)實(shí)現(xiàn)快速定量的一種檢測(cè)方法，該方法主要是對(duì)兩種經(jīng)過(guò)特別設(shè)計(jì)的序列特異性寡核苷酸做出運(yùn)用，基于熒光染料來(lái)對(duì)核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)雜交之后，這2種熒光染料在定位上十分接近，以此來(lái)為能量轉(zhuǎn)移提供便利，這種情況被稱作為熒光共鳴能量轉(zhuǎn)移。第1種染料主要是由于受到光釋放二極管的影響，其能量會(huì)朝第2種染料上進(jìn)行轉(zhuǎn)移。在此之后，第2種染料會(huì)對(duì)長(zhǎng)波的紅色熒光做出相應(yīng)的釋放。

（三）利用DNA芯片檢測(cè)

基因芯片技術(shù)主要包含有兩種模式：其一為將靶DNA朝支持物上進(jìn)行固定，這種方法和同時(shí)進(jìn)行大量不同靶DNA的分析之間較為符合，其二為將大量探針?lè)肿映С治锷线M(jìn)行固定，這種方法和對(duì)同一靶DNA實(shí)施不同探針序列的分析之間較為符合。主要是對(duì)DNA芯片技術(shù)做出采用，以細(xì)菌23rRNA基因序列信息以及耐藥基因?yàn)榛A(chǔ)，來(lái)將其充當(dāng)作檢靶基因，對(duì)基于豬沙門氏菌的寡核苷酸探針以及耐藥基因探針的基因芯片做出詳細(xì)的設(shè)計(jì)，以雜交反應(yīng)為基礎(chǔ)，來(lái)對(duì)致病菌以及其耐藥基因做出最終檢測(cè)。

六、防止耐藥性產(chǎn)生的對(duì)策

基于以下方法對(duì)耐藥性進(jìn)行控制，能夠使得耐藥菌株數(shù)量減少。具體為：

（一）加強(qiáng)藥政管理

對(duì)抗菌藥物在審批標(biāo)準(zhǔn)方面實(shí)施嚴(yán)格的管理，在對(duì)藥物進(jìn)行審批的過(guò)程中需對(duì)其耐藥性以及所存在的隱性影響做出考量，對(duì)獸用抗菌藥和人用醫(yī)療藥物進(jìn)行分開(kāi)放置；對(duì)抗菌藥物在質(zhì)量管理方面做出全面加強(qiáng)，盡量減少對(duì)抗菌藥物的使用；除此之外，針對(duì)監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性的和機(jī)構(gòu)做出專門的構(gòu)建，以細(xì)菌耐藥的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢(shì)作為基礎(chǔ)，對(duì)抗菌藥做出計(jì)劃性的使用。

（二）規(guī)范用藥

減少通過(guò)抗生素來(lái)對(duì)豬沙門氏菌病進(jìn)行預(yù)防的次數(shù)，以疫苗免疫機(jī)制為基礎(chǔ)對(duì)該病做出有效控制。在對(duì)豬沙門氏菌病實(shí)施治療的過(guò)程中，首先需采取藥敏試驗(yàn)，避免用低敏藥物來(lái)實(shí)施治療。另外，要基于適應(yīng)癥來(lái)對(duì)劑量以及療程做出確定，對(duì)由于劑量過(guò)大而導(dǎo)致的藥物浪費(fèi)和毒性反應(yīng)做出避免，避免因劑量不足而引發(fā)的病情延遷現(xiàn)象，減少慢性、復(fù)發(fā)以及耐藥性發(fā)生的幾率。

（三）新型抗菌藥物的研究

針對(duì)沙門氏菌耐藥性在獲取途徑以及耐藥性產(chǎn)生機(jī)理方面實(shí)施詳細(xì)的分析研究，對(duì)新的抗菌藥物做出持續(xù)的開(kāi)發(fā)，對(duì)干預(yù)措施做出制定來(lái)對(duì)耐藥性的產(chǎn)生做出有效避免，從而對(duì)越來(lái)越嚴(yán)峻的沙門氏菌耐藥性問(wèn)題做出有效防治。

結(jié)合以上所描述的，濫用抗生素屬于導(dǎo)致豬沙門氏菌具備耐藥性的主要影響因素，但耐藥基因的遺傳也屬于其中一個(gè)原因。根據(jù)相關(guān)資料得知，通常情況下，其耐藥性都是針對(duì)西藥的，而對(duì)于中藥則不明顯，由此能夠得知，在對(duì)豬沙門氏菌病做出治療時(shí)，需對(duì)中藥做出使用，若對(duì)西藥做出使用則需先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，通過(guò)高敏藥物來(lái)實(shí)施治療。

結(jié)論

豬沙門氏菌具備分布廣，危害大，傳播速度快以及耐藥性強(qiáng)等一系列特征，對(duì)于我國(guó)豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了極大程度的影響。本文針對(duì)豬沙門氏菌的流行現(xiàn)狀與危害、耐藥機(jī)理以及耐藥性的基因檢測(cè)方法進(jìn)行了詳細(xì)的分析探討，得出當(dāng)前豬沙門氏菌具備極強(qiáng)耐藥性的結(jié)論，相關(guān)人員需盡快找到抑制豬沙門氏菌耐藥性的對(duì)策和方法。

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