兒童肺炎支原體肺炎金屬基質(zhì)蛋白酶9血清水平測(cè)定及其外周血單核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)

徐穎， 招悅， 肖克林

兒童肺炎支原體肺炎金屬基質(zhì)蛋白酶9血清水平測(cè)定及其外周血單核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)

徐穎， 招悅， 肖克林

目的 探討肺炎支原體肺炎(MPP)患兒的金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)血清水平及其在外周血單核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，為MMP在免疫病理機(jī)制中的作用提供依據(jù)。方法 選取2015年1月至2016年8月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院小兒呼吸科接受治療和隨訪的急性MPP患兒78例作為研究對(duì)象，為觀察組。同期選取在本院進(jìn)行健康體檢的兒童78例作為對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法及實(shí)時(shí)定量PCR法分別檢測(cè)血清MMP-9水平以及MMP-9在外周血單核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。結(jié)果 觀察組急性期患兒血清MMP-9水平顯著高于恢復(fù)期，同時(shí)也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組恢復(fù)期兒童血清MMP-9水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組急性期患兒的外周血MMP-9 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率高于恢復(fù)期，同時(shí)也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 血清MMP-9和MMP-9 mRNA水平測(cè)定對(duì)于判斷病情具有重要意義。

肺炎支原體肺炎； 金屬基質(zhì)蛋白酶9； 酶聯(lián)免疫吸附法； 免疫； 兒童

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)作為當(dāng)前兒童群體中比較常見的一種非典型肺炎，近年來(lái)其發(fā)病率逐漸增高[1]。MPP不僅容易復(fù)發(fā)，重癥MPP還可能引起其他組織和器官發(fā)生病變，嚴(yán)重威脅兒童健康[2]。臨床研究證實(shí)，肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)對(duì)肺泡上皮細(xì)胞直接造成損傷和免疫系統(tǒng)功能紊亂在MPP的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[3]。金屬基質(zhì)蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一種能夠參與人體多種組織細(xì)胞外基質(zhì)的酶，其表達(dá)量少，但在生長(zhǎng)因子以及炎性細(xì)胞因子的刺激下其表達(dá)量明顯上升，因此在諸多病理和生理過(guò)程中均起著重要作用[4]。國(guó)內(nèi)外眾多研究證實(shí)，MMP-9在包括肺部炎性疾病在內(nèi)的多種炎性疾病中均存在表達(dá)過(guò)度現(xiàn)象，但有關(guān)MMP-9在兒童MPP發(fā)病機(jī)制中作用的文章卻鮮有報(bào)道[5]。本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法和實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)MMP-9的血清水平以及MMP-9在外周血單核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月至2016年8月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院小兒呼吸科接受治療和隨訪的急性MPP患兒78例作為研究對(duì)象，為觀察組，其中男42例，女36例；年齡1.3～11歲，平均(5.23±2.31)歲。同期選取在本院進(jìn)行健康體檢的兒童78例作為對(duì)照組，其中男40例，女38例；年齡1～10歲，平均(5.43±1.77)歲。兩組在性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版中MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。(1)MPP急性期標(biāo)準(zhǔn)：病程在10 d以內(nèi)，患兒住院前曾使用抗生素進(jìn)行治療但未見好轉(zhuǎn)并且未使用免疫調(diào)節(jié)劑以及糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療；患兒白細(xì)胞總數(shù)以及C反應(yīng)蛋白均輕度升高；血清MP-IgM抗體檢測(cè)為陽(yáng)性。(2)MPP恢復(fù)期標(biāo)準(zhǔn)：患兒胸部X線檢測(cè)顯示陰影消失或減輕；患兒肺部體征消失或減輕；咳痰、咳嗽等癥狀消失或減輕，體溫正常連續(xù)2周以上。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡1～11歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 伴有支氣管哮喘、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病者。

1.5 方法

1.5.1 MMP-9測(cè)定 抽取患兒和健康兒童外周靜脈血2 mL，利用肝素抗凝0.5 h后以1 000 r/min的速度離心30 min(離心半徑4.5 cm)，吸取血漿后在4 ℃環(huán)境下以1 000 r/min的速度再次離心30 min。利用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定MMP-9水平。試劑盒于美國(guó)Rapid Bio lab公司購(gòu)買，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 抽取患兒和健康兒童外周靜脈血5 mL，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液對(duì)抽取靜脈血中單核細(xì)胞進(jìn)行分離。利用Trizol試劑(上海翊圣生物科技有限公司)對(duì)總RNA進(jìn)行提取。測(cè)定A260～A280處吸光度值同時(shí)判定總RNA含量。對(duì)cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成后對(duì)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。本研究中PCR反應(yīng)條件設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火及延伸60 s，總計(jì)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。參照試劑盒對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清MMP-9水平比較 見表1。對(duì)MPP患兒進(jìn)行隨訪共追蹤到54例MPP患兒轉(zhuǎn)入恢復(fù)期。

組別發(fā)病階段nMMP-9對(duì)照組78141.85±39.43觀察組急性期78289.67±51.39a恢復(fù)期54145.36±38.77b

注：與對(duì)照組比較，at=12.58，P<0.05；與同組急性期比較，bt=11.68，P<0.05。

表1結(jié)果表明，觀察組急性期患兒血清MMP-9水平顯著高于恢復(fù)期，同時(shí)也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組恢復(fù)期兒童血清MMP-9水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組兒童外周血單核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)情況比較 見表2。

表2 兩組兒童外周血單核細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)情況比較(n)

注：與對(duì)照組比較，aχ2=9.20，P<0.05；與同組急性期比較，bχ2=8.85，P<0.05。

表2結(jié)果表明，觀察組急性期患兒的外周血MMP-9 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率高于恢復(fù)期，同時(shí)也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

MPP在臨床上也被稱為原發(fā)性非典型肺炎，是一種由MP引起的，病變主要發(fā)生在肺間質(zhì)以及支氣管的急性炎癥，多見于兒童和嬰幼兒[7]。近年來(lái)我國(guó)嬰幼兒MPP發(fā)病率逐漸上升，該病還具有病程長(zhǎng)而且容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制也有待進(jìn)一步研究和闡明。臨床研究證實(shí)，MP不僅僅是病原體，同時(shí)也是肺炎發(fā)生中重要的變應(yīng)原，使人體免疫系統(tǒng)激活并且誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[8-9]。細(xì)胞免疫系統(tǒng)在MPP患兒體內(nèi)起著調(diào)節(jié)其肺間質(zhì)性炎癥的作用。

MMP-9是MMP家族中質(zhì)量最大的一種酶，其在肺部正常細(xì)胞中通常不存在或者僅僅存在微量[10]。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，在多種刺激條件下，支氣管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞中均存在過(guò)量的MMP-9[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，MPP急性期患兒的血清MMP-9水平明顯高于MPP恢復(fù)期和對(duì)照組健康兒童，這也提示MPP急性期患兒MMP-9水平升高參與了機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，MP感染使患兒體內(nèi)大量產(chǎn)生MMP-9。MMP-9在作為機(jī)體炎性反應(yīng)的下游產(chǎn)物的同時(shí)，也促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生，加重患兒炎癥，在MPP的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。MMP-9 mRNA的正常表達(dá)是維持和調(diào)控正常組織的關(guān)鍵，但是這種作用在病變組織中卻會(huì)消失[13]。同時(shí)，MMP-9 mRNA是轉(zhuǎn)譯和調(diào)控MMP-9的重要指標(biāo)，對(duì)外周血MMP-9的表達(dá)起著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，急性期MMP患兒的外周血MMP-9 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率高于恢復(fù)期和對(duì)照組兒童，提示細(xì)胞免疫在由MP介導(dǎo)的炎性疾病中發(fā)揮著重要作用，并且能夠在mRNA表達(dá)上調(diào)時(shí)吸引單核中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，加速免疫細(xì)胞活化并且分泌更多MMP-9進(jìn)入到患兒外周靜脈血中，從而形成炎性浸潤(rùn)，殺傷和吞噬MP。

綜上所述，MMP-9作為一種炎性因子，在MPP的發(fā)病過(guò)程以及炎性浸潤(rùn)的免疫反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。血清MMP-9和MMP-9 mRNA水平測(cè)定對(duì)于判斷病情具有重要意義，能夠作為監(jiān)測(cè)患兒病情轉(zhuǎn)歸的輔助性實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)。

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(本文編輯：吳迪)

Determination of serum MMP-9 level and its gene expression in peripheral blood mononuclear cells in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia

XUYing，ZHAOYue，XIAOKelin.

DepartmentofPediatrics,Bao'anWomenandChildrenHealthCareHospital,Shenzhen518133，China

Objective To study the serum levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and its gene expression in peripheral blood mononuclear cells in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia(MPP), in order to provide a theoretical basis for the role of MMP in immune pathogenesis of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children.Methods Totally 78 cases of acute MMP patients treated and followed up in Department of Respiration of our hospital from January 2015 to August 2016 were selected as the observation group. Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and real-time quantitative PCR method were used to detect the level of serum MMP-9 in acute period and recovery period and the gene expression of MMP-9 in peripheral blood mononuclear cells; at the same time, a total of 78 healthy children in our hospital for health examination were selected as the control group and were given same testing.Results The level of MMP-9 in the acute stage of the observation group was significantly higher than that in the recovery stage and that of the control group(P<0.05), but there was no difference between the recovery stage and control group(P>0.05). At the same time, positive expression of MMP-9 mRNA in children at acute rate was higher than that at the recovery period and that of the control group(P<0.05).Conclusion The level of serum MMP-9 and the positive rate of MMP-9 mRNA are of great significance for the diagnosis of the disease.

Mycoplasma pneumoniae pneumonia; Matrix metalloproteinase-9; Enzyme-linked immunosorbent assay; Immunity； Children

2013年寶安區(qū)科技計(jì)劃-社會(huì)公益(醫(yī)療衛(wèi)生類)項(xiàng)目(2013077)

518133 廣東 深圳，深圳市寶安區(qū)婦幼保健院兒科

徐穎(1984-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。研究方向：小兒內(nèi)分泌疾病的診治

徐穎，E-mail：540589401@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.04.001

R725.6

A

1674-3865(2017)04-0277-03

2017-01-23)

臨床論著