西瓜細(xì)胞工程技術(shù)研究進(jìn)展

馬紹鋆

摘 要：西瓜是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，利用細(xì)胞工程技術(shù)可解決西瓜生產(chǎn)中的突出問(wèn)題。本文系統(tǒng)總結(jié)了國(guó)內(nèi)外關(guān)于西瓜細(xì)胞工程技術(shù)的研究進(jìn)展，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望，以期為西瓜細(xì)胞工程技術(shù)研究、品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

關(guān)鍵詞：西瓜；細(xì)胞工程；細(xì)胞遺傳學(xué)

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2017）14-0038-05

西瓜[Citrullus lanatus （Thunb.） Mansfeld，2n=2x=22]屬于葫蘆科西瓜屬，是世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是我國(guó)種植面積最大的主要瓜類作物，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)西瓜是農(nóng)民增產(chǎn)增收的重要渠道。西瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量受到遺傳基礎(chǔ)狹窄和病蟲(chóng)害等因素的影響，因此利用細(xì)胞工程技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、具有綜合抗性的西瓜新品種具有重要意義。本文系統(tǒng)總結(jié)了國(guó)內(nèi)外關(guān)于西瓜細(xì)胞工程技術(shù)的研究進(jìn)展，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望，以期為西瓜細(xì)胞工程技術(shù)研究、品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)

1.1 染色體核型分析

染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，可應(yīng)用于西瓜遺傳分析、進(jìn)化與品種間親緣關(guān)系研究，同時(shí)也為西瓜親本選配和新品種遺傳育種研究提供重要依據(jù)。一般依據(jù)染色體長(zhǎng)度、臂比、縊痕、隨體和核型不對(duì)稱系數(shù)等進(jìn)行[1]。

西瓜的染色體小，形態(tài)上不易識(shí)別，有絲分裂中期形態(tài)分化太少且細(xì)胞分裂時(shí)核膜消失較晚，染色體粘連等因素，導(dǎo)致染色體不易分散[2]，故一般選擇形態(tài)端正、分散良好的前中期染色體分裂相進(jìn)行核型分析。研究發(fā)現(xiàn)，西瓜根尖細(xì)胞分裂相受胚根長(zhǎng)短的影響，以胚根長(zhǎng)為1.0～1.5 cm的根尖細(xì)胞中期分裂相最多，鐵明礬-蘇木精染色觀察效果最

佳[3]。

目前關(guān)于西瓜染色體各種參數(shù)的報(bào)道不一致，Trivedi等[4]認(rèn)為，西瓜中期染色體長(zhǎng)度變化在1.24～2.88 μm，絕大部分為亞中著絲點(diǎn)（sm）染色體，無(wú)次縊痕，據(jù)郭德棟等[5]報(bào)道，Щелеина 等發(fā)現(xiàn)染色體長(zhǎng)度變化在1.5～4.0 μm，有1對(duì)隨體（SAT）染色體，而Φypca研究發(fā)現(xiàn)染色體長(zhǎng)度變化在1.8～2.7 μm，大都為中部著絲點(diǎn)（m）染色體，只有1對(duì)染色體不等臂。吳國(guó)江[2]建立了標(biāo)準(zhǔn)西瓜粗線期染色體核型，認(rèn)為西瓜粗線期染色體的染色粒呈近中分布類型，異染色區(qū)定位于著絲點(diǎn)附近，并對(duì)金夏西瓜品種進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)其為2n=2x=22=20 m+2 sm核型，染色體長(zhǎng)度變化在1.98～3.31 μm，除第2對(duì)染色體為次中部著絲點(diǎn)染色體外，均為中部著絲點(diǎn)染色體。趙虎基等[6]通過(guò)對(duì)12個(gè)西瓜品種染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，著絲點(diǎn)區(qū)和隨體未發(fā)生變異，籽用西瓜品種和飼用西瓜均為1A類型（2n=2x=22=20 m+2 sm或

22 m），與李琦等[7]的報(bào)道是一致的，而久比利、三單四和紅優(yōu)二號(hào)3個(gè)西瓜品種屬2A類型（2n=2x=22=20 m+2 sm或18 m+4 sm）且1A類型比2A類型對(duì)稱性高，說(shuō)明2A類型比1A類型進(jìn)化程度高。此外，張志忠等[8]采用玻璃針?lè)ǎ晒Ψ蛛x得到西瓜第一單染色體并進(jìn)行擴(kuò)增，建立了西瓜第一單染色體DNA文庫(kù)，為西瓜的基因定位和克隆奠定基礎(chǔ)。

1.2 染色體原位雜交

分子細(xì)胞遺傳學(xué)隨著染色體研究技術(shù)的創(chuàng)新而得到快速發(fā)展，出現(xiàn)了熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、基因組原位雜交（GISH）技術(shù)，為更精準(zhǔn)分辨染色體提供了一條途徑。FISH特點(diǎn)是敏感快捷，能同時(shí)顯示多種顏色等，因此能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針的定位以及次序確定，可應(yīng)用于準(zhǔn)確鑒定植物染色體，染色體識(shí)別、易位系鑒定、構(gòu)建物理圖譜、基因組進(jìn)化研究、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞學(xué)鑒定、外源染色質(zhì)檢測(cè)等。李琦等[7]應(yīng)用FISH技術(shù)成功將45S rDNA 和5S rDNA 定位在西瓜中期染色體上，雜交結(jié)果顯示西瓜

45S rDNA 雜交信號(hào)有2 對(duì)，較強(qiáng)的1對(duì)位于2號(hào)染色體短臂末端，較弱的1對(duì)位于4 號(hào)染色體短臂中部；5S rDNA 雜交信號(hào)有1對(duì)，位于7號(hào)染色體短臂近著絲粒處。趙泓等[9]以rDNA為探針，利用FISH技術(shù)通過(guò)對(duì)22份西瓜染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，三大生態(tài)類型（東亞類型、美洲類型和egusi類型）的17份西瓜栽培變種含有1對(duì)5S rDNA位點(diǎn)和2對(duì)45S rDNA位點(diǎn)。其中2對(duì)45S rDNA位點(diǎn)分別位于2對(duì)染色體長(zhǎng)臂非常接近末端的地方，信號(hào)亮度無(wú)明顯差異；5S rDNA位點(diǎn)位于其中1對(duì)45S rDNA位點(diǎn)內(nèi)側(cè)。4份栽培種中的野生變種含有5S rDNA位點(diǎn)和45S rDNA位點(diǎn)各2對(duì)，它們分別位于4對(duì)染色體的末端或近末端。而1份野生種具有的2對(duì)45S rDNA在信號(hào)亮度上無(wú)明顯差異，但其中1對(duì)靠近著絲粒的5S rDNA的拷貝數(shù)明顯少于另外1對(duì)靠近端部的5S rDNA，上述結(jié)果強(qiáng)有力地支持了現(xiàn)有的西瓜分類。

GISH可應(yīng)用于異源多倍體品種染色體結(jié)構(gòu)的分析和植物基因組結(jié)構(gòu)特征分析，能反映重復(fù)序列的信號(hào)分布特征，分析物種間親緣關(guān)系，其特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，更準(zhǔn)確直觀。常珂瑋等[10]通過(guò)對(duì)缺須西瓜、熱迷西瓜、藥西瓜和諾丹西瓜有絲分裂中期染色體進(jìn)行比較基因組原位雜交分析，揭示了西瓜屬物種間的親緣關(guān)系，同時(shí)對(duì)諾丹西瓜（2n=24）的歸屬問(wèn)題進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)西瓜（2n=22）與諾丹西瓜之間只在隨體上存在共享的同源重復(fù)序列，而甜瓜（2n=24）與諾丹西瓜之間共享的保守重復(fù)序列幾乎遍布諾丹西瓜的所有染色體，表明諾丹西瓜和甜瓜之間具有非常近的親緣關(guān)系。

2 組織培養(yǎng)

2.1 外植體培養(yǎng)

通過(guò)西瓜外植體培養(yǎng)獲得再生植株是離體培養(yǎng)中研究較多、較成熟的技術(shù)，在降低種苗成本、確保純度的同時(shí)也為重要性狀遺傳轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)?；蛐?、外植體類型、激素的種類和濃度、苗齡等因素影響西瓜再生體系的建立。

在離體培養(yǎng)中，西瓜未成熟子葉不定芽分化頻率可達(dá)100%，通常認(rèn)為子葉是比較理想的外植體[11]。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎在黑暗條件下發(fā)芽可以提高子葉的器官再生能力[12]，子葉的末端具有最高的再生頻

率[13]，再生不定芽最適培養(yǎng)條件為MS+1～2 mg/L

6-BA[12，14，15]。目前已經(jīng)建立了完善的子葉[16]、下胚

軸[17]和頂芽[18]等外植體的再生體系，以達(dá)到穩(wěn)定基因型的目的。有報(bào)道認(rèn)為，西瓜不定芽誘導(dǎo)頻率由高到低依次為莖尖[19]、帶完整子葉的頂芽[20]、子葉的末端[13]、不成熟的子葉[14]、0.5～1.0 cm胚軸[14]、3～

5 mm的果實(shí)切片[21]。此外，未受精胚珠和未授粉子房離體培養(yǎng)也有相關(guān)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，從授粉后結(jié)實(shí)14～28 d的西瓜以不成熟種子的子葉為外植體也可得到胚狀體，但再生頻率很低，因而通過(guò)體細(xì)胞胚得到再生植株不切實(shí)際[11]。而張莉[22]初步建立了西瓜體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體系，認(rèn)為在MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率達(dá)到54.7%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2%的蔗糖濃度適合西瓜體細(xì)胞胚萌發(fā)。閆

靜[23]建立了伊選類型和京欣類型西瓜愈傷組織的誘導(dǎo)體系，在MS+IAA 0.1 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L培養(yǎng)基中，兩類西瓜愈傷組織不定芽分化頻率最高。劉麗鋒[24]研究發(fā)現(xiàn)，鐵鹽對(duì)西瓜組培苗黃化的影響最大，將Fe-EDTA濃度加倍，組培苗生長(zhǎng)健壯，能持續(xù)繼代。此外，西瓜在離體培養(yǎng)過(guò)程中易產(chǎn)生玻璃化苗，有報(bào)道認(rèn)為，降低培養(yǎng)濕度可有效減少玻璃化苗的發(fā)生[25]。

2.2 花藥和小孢子培養(yǎng)

西瓜花藥培養(yǎng)受多種因素的影響，包括基因型差異、小孢子的發(fā)育階段、花蕾的預(yù)處理方式、供體植株的生理狀態(tài)、基本培養(yǎng)基成分等因素[26]，其中培養(yǎng)基的組成是影響誘導(dǎo)胚狀體形成愈傷組織和植株再生的關(guān)鍵因素。

西瓜花藥培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代初，通過(guò)對(duì)瓊酥和周至紅2個(gè)西瓜品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得了單倍體植株，但其愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為0.5%，不利于育種上利用。薛光榮等[27]通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得的花粉植株經(jīng)過(guò)加倍得到了1個(gè)高產(chǎn)、抗病的西瓜優(yōu)良品種。袁萬(wàn)良等[28]通過(guò)改良培養(yǎng)基，解決了愈傷組織褐變死亡的問(wèn)題，將愈傷組織誘導(dǎo)率從0.5%提高到94.4%，并且快速誘導(dǎo)出了綠色愈傷組織，為獲得西瓜單倍體植株奠定了基礎(chǔ)。魏瑛等[29]通過(guò)對(duì)西農(nóng)8號(hào)和京欣l號(hào)2個(gè)西瓜品種花藥進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，獲得了57.7%～62.9%的誘導(dǎo)率。李娟[30]認(rèn)為在4℃處理2 d條件下，西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+KT 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，誘導(dǎo)率為57.84%。西瓜花藥培養(yǎng)技術(shù)雖有較多優(yōu)勢(shì)，但由于花藥愈傷組織誘導(dǎo)率低以及分化頻率極低等問(wèn)題的存在，目前仍未能廣泛應(yīng)用于西瓜遺傳育種中。

小孢子培養(yǎng)排除了藥壁組織二倍體體細(xì)胞的干擾，是獲得單倍體的重要途徑之一，可為快速配制雜交種提供材料，也是分子標(biāo)記和基因圖譜的理想材料?；ǚ鄣陌l(fā)育時(shí)期是決定花藥培養(yǎng)能否形成花粉愈傷組織或花粉植株的至關(guān)因素之一。王玉英等[31]認(rèn)為大多數(shù)植物在單核靠邊期進(jìn)行花藥培養(yǎng)效果是最佳的。李娟[30]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜花藥培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期到雙核期，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究，此外不同基因型西瓜在游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)溫度的敏感性不同，同時(shí)早上采集花蕾其花粉活力較強(qiáng)，高溫?zé)峒?6℃處理4 d的效果較好，在1/2 NLN液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，小孢子能膨大分裂形成細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織。

2.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體為遺傳操作提供了理想受體，通過(guò)該技術(shù)可獲得體細(xì)胞雜交種，目前采用電融合技術(shù)成功地進(jìn)行了西瓜和甜瓜原生質(zhì)體的融合，通過(guò)Southern 分子印記雜交技術(shù)，檢驗(yàn)出了原生質(zhì)體異融合愈傷組織，該方法可以克服遠(yuǎn)緣雜交不育和縮短育種年限[32]，同時(shí)也為創(chuàng)造新材料和新種質(zhì)開(kāi)辟新途徑。李仁敬等[33]通過(guò)化學(xué)融合，以西瓜子葉原生質(zhì)體獲得愈傷組織，并發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體的分裂頻率與基因型有關(guān)。王靜[34]建立了西瓜葉片原生質(zhì)體制備的最佳條件，為2.7%纖維素酶+0.78%離析酶R-10溶于0.4 mol/L甘露醇中，轉(zhuǎn)速800 r/min，酶解時(shí)間120 min，西瓜葉片原生質(zhì)體產(chǎn)率最高，制備效果最好。

3 基因轉(zhuǎn)化

抗性育種對(duì)于培育生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)西瓜品種具有重要意義，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以為抗性育種提供支持。西瓜轉(zhuǎn)基因主要以子葉為外植體，遺傳轉(zhuǎn)化方法除農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是技術(shù)較成熟、機(jī)理較明確的途徑外，花粉管通道法[35]、基因槍介導(dǎo)法[36]、DNA浸胚法[37]、胚囊子房注射法[38]、PEG法、電激法等也有

應(yīng)用。

目前已成功將卡那霉素抗性篩選基因（NPTⅡ）和標(biāo)記基因（GUS）[15]、ACC合成酶基因及其反義基因[39]、西瓜花葉病毒1號(hào)的外殼蛋白基因（WMV-1 CP 基因）[40]、西瓜花葉病毒2號(hào)的外殼蛋白基因（WMV-2 CP 基因）[41]、西瓜花葉病毒（WMV）外殼蛋白基因、西葫蘆黃化花葉病毒（ZYMV）復(fù)制酶基因、黃瓜花葉病毒（CMV）復(fù)制酶基因[42]、NPR1基因、幾丁質(zhì)酶基因、幾丁質(zhì)酶-葡聚糖酶雙價(jià)基

因[43]、酵母腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因[44]、酵母HALI基因[45]、八氫番茄紅素合成酶基因[46]、GGPS基因、編碼CGMMV-CP的cDNA基因等成功轉(zhuǎn)入西瓜基因組中獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。與西瓜有近緣關(guān)系物種的總DNA也有應(yīng)用，如瓠瓜DNA、黑籽南瓜DNA等。宋道軍等[47]利用離子束處理將銀杏耐輻射異常球菌基因組DNA成功導(dǎo)入西瓜，該方法實(shí)現(xiàn)了超遠(yuǎn)緣分子雜交，為西瓜遺傳育種拓展了新方法。此外，體細(xì)胞突變體篩選也可作為西瓜抗性種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。

4 問(wèn)題與展望

隨著細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞遺傳學(xué)、組織培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)化等在西瓜遺傳育種中得到了廣泛應(yīng)用，但以下問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。

①西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄利用離體培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生體細(xì)胞無(wú)性系變異的特性，應(yīng)加強(qiáng)體細(xì)胞無(wú)性系變異的篩選研究，重視抗性突變體篩選、抗病種質(zhì)資源匱乏以及抗病性遺傳規(guī)律復(fù)雜等問(wèn)題。

②獲得高頻、高質(zhì)、同步性好的體細(xì)胞胚是人工種子生產(chǎn)的關(guān)鍵。通過(guò)細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)三倍體無(wú)籽西瓜人工種子，可以降低種苗成本。

③西瓜花藥培養(yǎng)單倍體的誘導(dǎo)率低，重復(fù)性差，有待于進(jìn)一步提高。

④西瓜細(xì)胞工程研究體系的培養(yǎng)效率不高，后代群體不夠大，不利于在遺傳育種中的應(yīng)用。

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Abstract： Watermelon is one of the most important cash crop in the worldwide. Research on cell engineering technology is actually an effective way to solve a series of problems in watermelon production. This paper systematically summarized the research achievements of cell engineering technology in watermelon， and also suggested some future directions which could provide valuable references for the research of cell engineering technology， cultivar improvement and germplasm

innovation.

Key words： Watermelon； Cell engineering； Cell genetics