RP—HPLC法同時(shí)測(cè)定舒胸顆粒中3種皂苷類成分的含量

符傳山+洪挺+王笑琴

[摘要] 目的 建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定舒胸顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量測(cè)定方法。 方法 采用色譜柱Diamosil C18（4.6×250mm，5μm），柱溫30℃，流動(dòng)相乙腈-水，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。 結(jié)果 3個(gè)皂苷類成分色譜峰面積與對(duì)照品進(jìn)樣量均呈良好的線性關(guān)系，r≥0.9993；樣品加樣回收率在98.9%～99.7%之間，RSD均小于1.4%。 結(jié)論 該方法靈敏度高、專屬性好、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可為舒胸顆粒質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] RP-HPLC；舒胸顆粒；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1

[中圖分類號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）13-33-03

[Abstract] Objective To establish a method for the simultaneous determining of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 in Shuxiong Granules by RP-HPLC. Methods The RP-HPLC analysis was performed on a Diamosil C18 （4.6×250 mm，5μm）， the mobile phase was acetonitrile and water with gradient elution. The detection wave length was 203nm and the coumn temperature was 30℃. Results There was a good linear relationship between the peak area and the sample quantity for the three saponins， r≥0.9993. The recovery was between 98.9%-99.7% with RSD<1.4%. Conclusion The method has the advantage of sensitivity， specificity， simple operation， and repeatability. It is suitable for the quality control of Shuxiong Granules.

[Key words] RP-HPLC； Shuxiong granules； Notoginsenoside R1； Ginsenoside Rg1； Ginsenoside Rb1

舒胸顆粒由三七、紅花、川芎3味藥制成，主要用于瘀血阻滯所致的胸痹，癥見(jiàn)胸悶、心前區(qū)刺痛；冠心病心絞痛。本品種原標(biāo)準(zhǔn)[1-2]分別收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第27冊(cè)和第37冊(cè)，均采用薄層掃描法測(cè)定君藥三七中人參皂苷Rg1的含量。由于三七中含有皂苷類成分較多，僅控制人參皂苷Rg1的含量不夠全面，而且薄層掃描法的重現(xiàn)性不好。為有效控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，經(jīng)查閱文獻(xiàn) [3-6]，研究建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定舒胸顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量測(cè)定方法。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)被《中國(guó)藥典》2015年版一部[7]收錄。

1 儀器與試藥

美國(guó)沃特斯2695 alliance高效液相色譜儀，配備四元泵、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、高精度自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower數(shù)據(jù)采集處理工作站；德國(guó)Sartorius BP211D電子天平；Milli-Q超純水機(jī)；昆山KQ-5200B型超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào)分別為110703-200424、110704-200318、110745-200414；乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純；舒胸顆粒樣品7批分別由A公司（規(guī)格：每袋裝3g，批號(hào)為 080603、080903、080802、080902）、B公司（規(guī)格：每袋裝1g，批號(hào)為070501、070502、070503）提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的配制 分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為2.21、1.72、1.04 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取一定體積的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋成0.221、0.172、0.104 mg/mL混合對(duì)照品溶液，搖勻，備用。

2.1.2 樣品溶液的配制 取舒胸顆粒適量，研細(xì)，取粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，靜置12h，然后于80℃水浴上加熱回流2h，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液用微孔濾膜（0.22μm）濾過(guò)，續(xù)濾液備用。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的配制 按處方量稱取紅花、川芎2味藥，照舒胸顆粒生產(chǎn)工藝制備陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品適量，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，備用。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Diamosil C18柱（4.6×250mm，5μm），柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，按表1進(jìn)行梯度洗脫；理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000。結(jié)果顯示三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1保留時(shí)間分別約為29.4、32.9、56.9min，與其他組分峰的分離度大于1.5，陰性對(duì)照樣品在相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、20、30、50μL，注入液相儀，照上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。以每個(gè)對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明均呈良好的線性關(guān)系，線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件，進(jìn)樣20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰的峰面積。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.66%、0.54%和0.56%（n=6），均符合精密度實(shí)驗(yàn)要求。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)070501舒胸顆粒樣品，研細(xì)，取粉末0.5g，共6份，精密稱定，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，進(jìn)樣20μL。結(jié)果樣品中三七皂苷R1 ，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均含量分別為3.19mg/g、14.0mg/g、10.9mg/g，RSD分別為1.2%、1.0%、1.5%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)070501舒胸顆粒樣品溶液，室溫下放置，分別于0，4，8，12，16 h重復(fù)進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為1.3%、0.39%、0.78%。數(shù)據(jù)說(shuō)明該樣品溶液在室溫下放置16h所測(cè)成分穩(wěn)定性良好。

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)070501舒胸顆粒樣品，研細(xì)，取粉末0.25g，共6份，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1濃度分別為0.0400、0.0328、0.0268mg/mL）50mL，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液并進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1平均回收率為99.7%、98.9%、99.0%，RSD為1.3%、1.1%、1.0%。數(shù)據(jù)表明該方法回收率較好。

2.3.6 樣品測(cè)定 取7批舒胸顆粒，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的紫外光譜均屬末端吸收，且在203nm處有最大吸收，因此選擇203nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 提取方式的優(yōu)化

目前測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量的方法，文獻(xiàn)報(bào)道主要有HPLC法[8-15]和TLC掃描法，但未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定舒胸顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1三個(gè)成分的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究對(duì)樣品溶液的提取方法進(jìn)行了熱回流和超聲提取的考察，結(jié)果表明：熱回流法比超聲處理法所測(cè)含量更大，說(shuō)明其提取更完全，故選擇熱回流提取；本研究還對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別考察了熱回流1、2、3h的提取情況，結(jié)果表明：熱回流2h三種皂苷含量最高，3h與2h無(wú)差別，這說(shuō)明2h已經(jīng)提取較為完全，為節(jié)約時(shí)間，提高效率，故選擇提取2h；另外，本研究還對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考察，分別采用甲醇、乙醇、50%甲醇三種溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：甲醇提取三種皂苷含量最高，其提取最為完全，故最終確定甲醇為提取溶劑。

3.3 耐用性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別采用A： DIKMA Diamonsil C18柱（4.6×250mm，5μm）；B： Alltech Apollo C18柱（4.6×250mm，5μm）；C： Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6×150mm，5μm）三種不同品牌和填料的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰在各種色譜柱上均分離良好，結(jié)果無(wú)明顯差異，該方法耐用性良好。

本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定舒胸顆粒中3種皂苷的含量，方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均能滿足定量分析要求，對(duì)評(píng)價(jià)舒胸顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-07）