天然維生素E的檢測技術(shù)研究進展

王石，王峻，肖志明，王燕妮，鄧濤，樊霞*

檢測分析

天然維生素E的檢測技術(shù)研究進展

王石1，王峻2，肖志明1，王燕妮1，鄧濤1，樊霞1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（北京），北京海淀100081；2.湖北省飼料監(jiān)測所，湖北武漢430070）

天然維生素E是植物油中普遍存在的一類抗氧化劑，因其具有安全、高效、無毒等優(yōu)點被人們廣泛關(guān)注。近年來，隨著天然維生素E在食品、飼料、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的逐步應(yīng)用，其檢測和品控技術(shù)也在不斷發(fā)展，研究人員根據(jù)維生素E的物理、化學性質(zhì)開發(fā)了多種檢測方法。本文主要簡述了色譜技術(shù)、光譜技術(shù)以及電化學分析技術(shù)等在天然維生素E檢測中的應(yīng)用，探討了這些分析方法的基本原理以及優(yōu)缺點，比較了各方法的靈敏度、準確性和檢測極限等指標，便于在分析實際樣品時選擇最合適的測定方法。

天然維生素E；生育酚；生育三烯酚；檢測技術(shù)

維生素E又被稱為抗不育維生素，是人體所必需的一種脂溶性維生素，其按照來源可以分為天然維生素E和合成維生素E。天然維生素E中含有8種異構(gòu)體，即4種生育酚（α-T，β-T，γ-T，δ-T）和4種生育三烯酚（α-T3，β-T3，γ-T3，δ-T3），其廣泛存在于自然界中，在植物的桿、莖、葉、種子胚、植物油脂、奶和蛋黃中均有存在，尤以小麥胚芽中含量最高（張彩麗等，2005）。市售的天然維生素E就是以富含維生素E的植物油或精煉副產(chǎn)品的脫臭餾分為原料，經(jīng)提取、純化制得，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在藥品、化妝品、保健品以及飼料等領(lǐng)域（田少云，1995）。

1 天然維生素E的應(yīng)用

維生素E能夠促進性激素分泌，提高生育能力，并具有預(yù)防流產(chǎn)等作用。同時作為重要的生物抗氧化劑，維生素E還能提高機體中的抗氧化酶的活性，降低機體中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量。研究表明，在維生素E的眾多異構(gòu)體中，α-生育酚具有最高的生物活性，在生物體內(nèi)更容易吸收且具有更高的利用率（吳金龍，2009），但是其他維生素E的異構(gòu)體在人體中也有著很重要的作用。例如，γ-生育酚（γ-T）具有抗癌的功能，并能有效地預(yù)防由中樞腦動脈阻塞引起的腦梗死（Jiang等，2004）。δ-生育酚（δ-T）對人乳腺癌細胞的抑制作用明顯強于其他生育酚單體（Yu等，1999）。生育三烯酚（T3）能夠抑制膽固醇合成，減少血漿膽固醇含量，以減少心腦血管病發(fā)的可能性，有效抑制腫瘤細胞的增殖（Das等，2007；Sen等，2006）。因此建立天然維生素E的檢測方法，分析樣品中的不同生育酚和生育三烯酚的含量及分布，有利于指導人們更加有效、合理的使用天然維生素E，使天然維生素E產(chǎn)生更高的應(yīng)用價值。另一方面，天然維生素E是從植物油中提取得到，具有很小的毒害，而合成維生素E則是由化工原料經(jīng)化學合成制得，難免有化學物質(zhì)殘留。天然維生素E無論是從生理活性還是抗氧化能力均優(yōu)于合成維生素E，更重要的是天然維生素E對人體沒有任何毒副作用，長期使用的安全性遠高于合成維生素E。由于以上諸多原因，天然維生素E的市售價格要遠高于合成維生素E。因此市場上難免會出現(xiàn)在天然維生素E中摻入合成維生素E，以次充好，非法謀取利潤的現(xiàn)象。完善天然維生素E的檢測方法，分析天然維生素E中各種異構(gòu)體的含量，對建立天然維生素E產(chǎn)品的真實屬性圖譜庫，有效的規(guī)范天然維生素E的銷售市場，促進天然維生素E行業(yè)的發(fā)展意義重大。

2 天然維生素E的檢測方法

2.1 色譜法與色-質(zhì)聯(lián)用法

2.1.1 氣相色譜與氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)氣相色譜技術(shù)主要是利用物質(zhì)的沸點、極性及對固定相吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。由于樣品中各組分的沸點、極性或吸附性能不同，每種組分都在流動相和固定相之間進行反復多次的分配或吸附/解吸，在載氣中濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出，從而達到了分離的目的（齊景杰，2012）。由此可見，氣相分離主要受目標物的汽化難易程度和分子對固定相的吸附影響，跟分子的化學結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在天然的維生素E中含有α、β、γ、δ-生育酚以及生育三烯酚等8種結(jié)構(gòu)類似物，其中β、γ-生育酚和β、γ-生育三烯酚在苯環(huán)的鄰位和間位皆有1個甲基取代，只是取代基團的位置不同，互為同分異構(gòu)體。因此β與γ-生育酚，β、γ-生育三烯酚沸點相近，極性相似，從而造成氣相色譜很難將這兩組同分異構(gòu)體分離（魏雪緣等，2016）。

國際標準方法（AOAC Official Method 988.14，F(xiàn)irst Action 1988）和國家標準（GB 19191-2003）作為現(xiàn)行有效的天然維生素E的檢測標準，均選擇以正己烷或吡啶為提取溶劑，非極性柱作為固定相，十六酸十六酯為內(nèi)標物，通過氣相色譜對天然維生素E進行檢測，測定了天然維生素E粉中的生育酚，該法可很好的對各組分進行定量檢測，但β、γ-生育酚不能分離檢測。鮑忠定等（2009）通過皂化法對油脂樣品進行前處理，之后通過毛細管氣相色譜法測定了樣品中的D-α-生育酚和L-α-生育酚含量。羅赟等（2013）以石油醚-乙醚提取維生素E，通過超聲浸提法前處理后，HP-5毛細管柱分離，并以三十二烷為內(nèi)標物，檢測了食品中的4種生育酚。該法最低檢出限分別為：α-VE 4 ng，β-VE 12 ng，γ-VE 12 ng，δ-VE 24 ng，回收率為83.4%～100.2%，方法精密度良好，但β-VE與γ-VE無法達到完全分離。同時，也有研究人員使用MSTFA作為衍生化試劑，對維生素E進行硅烷化處理，檢測植物油中的4種生育酚，生育酚可達到基線分離，方法的重復性及準確性良好，回收率為75%～111%（Lechner等，1999）。Lu課題組（2015）以二苯蒽作為內(nèi)標物，使用甲醇-正己烷作為溶劑處理功能食品和保健品，通過質(zhì)譜檢測器進行選擇離子掃描，該方法可以檢測功能食品中的8種維生素E和α-生育酚乙酸酯，方法檢出限為0.09～0.46 ng/mL。同樣的，Zerbinati等（2015）通過氣質(zhì)結(jié)合衍生化處理方法，測定了血液血漿中的α、γ-生育酚，實現(xiàn)α、γ-生育酚的定量檢測。

2.1.2 液相色譜與液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)高效液相色譜法（HPLC）是目前應(yīng)用最為廣泛的分離、分析、純化有機化合物的方法之一。不同結(jié)構(gòu)物質(zhì)在流動相與固定相之間的分配比不同，造成不同組分在色譜柱上的出峰時間順序不同。利用該原理，HPLC實現(xiàn)了目標物分離、檢測的目的。目前，天然維生素E的檢測方法中以該法應(yīng)用最為廣泛，眾多HPLC檢測方法見表1。

生育酚和生育三烯酚皆是由13個碳原子的長脂肪鏈和色滿環(huán)組成的化學分子，只是在色滿環(huán)上的取代基不同。在通過反相色譜進行分離時（如C18為填料），長脂肪鏈易于吸附在固定相上，洗脫溶劑對生育酚的作用效果差別不大，造成用反相色譜很難分離。而使用正相色譜，以硅膠為固定相，色滿環(huán)上的酚羥基易于吸附在固定相表面，甲基的取代結(jié)果將影響苯環(huán)上π電子云密度以及吸附基團的空間位阻，從而影響色滿環(huán)上酚羥基對硅羥基的吸附。由DFT泛函理論計算得到α、β、γ、δ-生育酚中色滿環(huán)酚羥基上氧原子的密立根電荷分別為-0.587＜-0.577＜-0.576＜-0.572，而4種生育酚在正相柱上的保留分別為δ-生育酚＞γ-生育酚＞β-生育酚＞α-生育酚，由此可見，甲基取代產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)差異可以很容易的使4種生育酚在正相色譜柱上有效分離。

根據(jù)以上的討論可以總結(jié)出：（1）基于反相色譜建立的多種維生素異構(gòu)體分離檢測方法，操作簡單，重現(xiàn)性好，但β、γ-生育酚很難得到分離，要得到較好的分離效果則必須在方法中使用更加高效的色譜柱（特殊填料或者較小的粒徑）以及精確控制的梯度洗脫程序。（2）基于正相色譜建立的多種維生素異構(gòu)體分離檢測方法，8種維生素E很容易得到基線分離，但正相色譜的保留時間不穩(wěn)定，操作復雜，需要更長的平衡時間以及更大的溶劑毒性也限制了該方法的使用（徐響等，2008）。

2.1.3 超高效合相色譜技術(shù)超高效合相色譜（UPC2TM）是分離科學的一個新類別。該技術(shù)將SFC與UPLC技術(shù)相結(jié)合，通過調(diào)節(jié)壓力、溫度以及選擇適合的流動相和固定相類型，可以有效地分離、檢測結(jié)構(gòu)類似物、同分異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體等現(xiàn)有方法難以處理的樣品。該方法目前已被用于分析水果中α-生育酚的含量（Gong等，2014），同時Gee（2016）和Ningli課題組（2016）還分別使用UPC2技術(shù)分離了天然維生素E中的8種生育酚。Ningli課題組（2016）使用BEH 2-EP型色譜柱作為固定相，超臨界CO2為流動相，甲醇/異丙醇（1∶1，v/v）作為改性劑，在倍壓1800 psi下對樣品進行分離。DAD檢測器的檢出限為23～49 ng/L，建立方法可準確檢測辣木枝葉中的天然維生素E，方法重現(xiàn)性良好（RSD 0.62%～3.16%）。UPC2使用超臨界CO2作為主要流動相，其流體黏度小，比HPLC中所使用的液體流動相擴散率更高、更有利于傳質(zhì)。而與GC相比，CO2作流動相可在低溫下實現(xiàn)物質(zhì)分離，特別適合熱敏性化合物的樣品分析。因而超高效合相色譜法很適合分離，檢測蔬菜、水果及食用油中的天然維生素E。

表1 高效液相色譜法檢測不同基質(zhì)中的天然維生素E

2.1.4 毛細管電泳技術(shù)毛細管電泳技術(shù)是以高壓電場為驅(qū)動力，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分在毛細管中遷移速度的不同而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。而在此基礎(chǔ)上進一步發(fā)展的非水毛細管電泳技術(shù)（NACE），由于使用有機溶劑作電泳緩沖液，可增加疏水性物質(zhì)的溶解度，特別適用于在水中難溶或在水溶液中性質(zhì)相似的物質(zhì)分離。Galeano-Día扎（2012）基于此項技術(shù)建立了植物油中4種天然維生素E的檢測方法。其以無水甲醇溶液為電泳介質(zhì)，硼酸鹽緩沖液、膽酸鈉溶液和氫氧化鈉溶液作為改性劑，熔融石英毛細管為分離通道對天然維生素E進行分離，其遷移順序為：α-生育酚＜（β+γ）-生育酚＜δ-生育酚。進一步利用該法對玉米胚芽油、橄欖油及葵花籽油中的生育酚進行測定，發(fā)現(xiàn)在定量范圍1.0～50.0μg/mL，其與RPLC法的測定結(jié)果相近。由于NACE法可承受更大的進樣量，產(chǎn)生很好的樣品堆積效應(yīng)，因此適合天然維生素E各單體的分離制備；但該法還不能達到HPLC分離效果，無法實現(xiàn)β與γ-生育酚的有效分離。

2.1.5 TLC薄層色譜技術(shù)草粉是家禽日糧中天然維生素E的重要來源。早在1978年，烏克蘭家禽研究所為了測定草料中的α-生育酚含量，建立了基于TLC色譜技術(shù)的快速檢測方法。該方法以苯作為提取溶劑，硅膠板作為固定相，氯仿為流動相，同時以氯化鐵與2，2-聯(lián)吡啶混合溶液作為顯色劑，可對草粉中天然維生素E進行分離，并對α-生育酚進行快速半定量檢測（盛蘊純等，1987）。TLC法前處理簡單，操作方便，且目前TLC技術(shù)已完全實現(xiàn)自動化，更加快速、高效、準確。然而薄層色譜理論塔板數(shù)較低，分離效率差，很難實現(xiàn)天然維生素E各異構(gòu)體之間的分離，目前已基本不再應(yīng)用。

2.2 光譜法快速檢測技術(shù)因具有實驗操作簡化、檢測用品易得、分析方法快速、準確等特點，應(yīng)用前景十分廣闊。通過快速檢測技術(shù)對食品、飼料、醫(yī)藥化妝品的質(zhì)量進行有效的評價已成為目前檢測領(lǐng)域的研究熱點，也是未來的發(fā)展方向。光譜法由于不需要對樣品進行復雜的前處理，操作簡單，響應(yīng)快，因而更容易實現(xiàn)快速檢測。然而光譜法沒有色譜技術(shù)的分離功能，所以很難檢測到天然維生素E的各種單體，只能測量得到總維生素E的含量。

2.2.1 紫外分光光度法維生素E結(jié)構(gòu)中含有游離的酚羥基，可被強氧化劑氧化生成醌。生育酚可以將三價鐵離子還原成二價鐵離子，二價鐵離子可與1，10-菲繞啉發(fā)生有色反應(yīng)，于某一波長下具有最大吸收，在一定濃度范圍內(nèi)，其吸收值與生育酚含量成正比（劉云等，2005）。利用該原理，劉云等（2005）建立了油脂中天然維生素E的紫外分光光度檢測方法，研究了顯色劑、反應(yīng)劑及終止劑濃度、反應(yīng)時間、最大吸收波長等參數(shù)對天然維生素E檢測的影響，確定了最佳檢測條件。檢測結(jié)果與HPLC結(jié)果相比，最大偏差不超過5%。崔恩惠在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面實驗，優(yōu)化了分光光度法測定天然維生素E時的顯色反應(yīng)條件，得到了最佳反應(yīng)條件。在此條件下，該法可實現(xiàn)1～21μg/mL濃度范圍內(nèi)維生素E的定量檢測回收率高于97%。通過多次實驗發(fā)現(xiàn)，分光光度法測定天然維生素E效果良好，而對于工業(yè)合成的dl型維生素E，其顯色反應(yīng)活性較低，測定效果不理想。

2.2.2 近紅外光譜法近紅外光譜（NIR）是介于可見光和中紅外光之間的電磁波譜，波數(shù)約為10000～4000 cm-。在近紅外區(qū)域產(chǎn)生的特征吸收主要為化合物極性官能團化學鍵的伸縮振動倍頻和合頻。通過適當?shù)幕瘜W計量學多元校正方法，把校正后樣品的近紅外吸收光譜與其成分濃度或性質(zhì)數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)，建立校正樣品吸收光譜與其成分濃度或性質(zhì)間的關(guān)系-校正模型（石冬冬等，2015）。應(yīng)用該模型，人們可對待測樣品進行定性或定量檢測。Silva等（2005）采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學計量學工具對植物油中的天然維生素E進行了定量檢測。首先通過光譜掃描獲得了α-生育酚的紅外光譜信息，之后建立了不同特征波段的偏最小二乘法（PLS）回歸模型，通過優(yōu)化條件，最終選擇以1472～1078 cm-波段的圖譜信息建立了校正模型。該課題組在衰減全反射模式下對混合油、菜籽油、花生油、大豆油及葵花籽油等5種食用植物油中的α-生育酚進行定量檢測，并將測定結(jié)果與RPLC比較，結(jié)果表明，兩種方法的測定結(jié)果無顯著差異。FTIR測定植物油中的α-生育酚不需對樣品進行復雜前處理，方法快速、準確、不消耗化學試劑，但檢測結(jié)果易受基質(zhì)干擾，不能用于成分復雜樣品中的α-生育酚的測定，且校正模型的優(yōu)劣決定了定量和定性分析的準確性，因此近紅外光譜分析需要持續(xù)添加樣本對模型進行校正。

2.2.3 拉曼光譜法拉曼光譜有其獨特的檢測特性，可對有機物結(jié)構(gòu)上的基團的振動和轉(zhuǎn)動產(chǎn)生相應(yīng)的信號，利用該信息可以進行相應(yīng)的定性與定量分析（Cimpiu等，2005）。拉曼光譜對有機分子中的C=C鍵、C=N鍵、C=O鍵等基團具有很強的響應(yīng)，而且其譜峰相對較窄，受到基質(zhì)的干擾更小，可避免近紅外光譜中存在光譜重疊、無特征吸收的特點，可作為近紅外技術(shù)的補充技術(shù)，用于對天然維生素E等一些常規(guī)指標進行評價。同時，該法具有無損、便攜和快速檢測的特點與優(yōu)勢，是一種綠色環(huán)保的分析測定方法。

2.2.4 熒光光譜法維生素E同系物具有相同的共軛雙鍵體系，因此其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜非常相近（相差±2 nm），通過該原理，人們可通過熒光法測定樣品中總維生素E含量。李英麗等（2009）以石油醚作為萃取溶劑，通過同步熒光檢測了蔬菜中天然維生素E，消除了萃取溶劑對目標物的熒光干擾。該法定量限為0.01 mg/L，操作較為簡便、快速，如遇到樣品中同時含有維生素E和其他維生素時，也可使用熒光法實現(xiàn)不分離測定混合物中的維生素E。闞健全（1990）建立了食品中維生素E和維生素A的熒光檢測方法，分別在Ex340、Em480 nm和Ex295、Em340 nm處同時測定了試樣中的維生素A和維生素E，結(jié)果表明，在濃度為0.05～10.00μg/mL時，維生素E的回收率為90.7%～95.9%。熒光法測定維生素E含量時，需要防止樣品中某些干擾熒光強度的物質(zhì)的存在，因此對樣品前處理，特別是樣品凈化步驟有著嚴格的要求。一般在檢測植物油中的天然維生素E時，都需要對樣品進行皂化，以減少樣品基質(zhì)對檢測的干擾。

2.3 電化學分析法電化學法測定植物提取物中的維生素E，是利用維生素E結(jié)構(gòu)中的酚羥基可在電極上發(fā)生不可逆氧化，通過測定氧化峰電流計算植物提取物中的維生素E含量。但由于維生素E各異構(gòu)體的氧化電位差別小，電化學圖譜上各生育酚氧化峰發(fā)生重疊，電化學分析法只能測定植物油中維生素E的總量，無法獲取各生育酚單體的定量信息。而Robledo等（2013）通過電化學法結(jié)合非線性人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立校正模型，成功的從生育酚重疊的信號中獲取各生育酚異構(gòu)體的定量信息，實現(xiàn)了對植物油中α-，γ-和δ-生育酚的測定。該法測定植物油中維生素E，具有檢測速度快，靈敏度高的優(yōu)點，但該法在檢測中易受到復雜基質(zhì)的干擾，同時該法需要建立校正模型，將耗費較多的費用和時間進行模型建立與維護。

2.4 滴定法（鈰量法）鈰量法也稱硫酸鈰法，是采用四價鈰鹽溶液作滴定劑，在酸性條件下測定還原性物質(zhì)的滴定方法。用鄰二氮菲作指示劑時，要求待測組分的還原性比指示劑強。張乃明等（2002）通過研究影響維生素E測定結(jié)果的因素，優(yōu)化了飼料添加劑維生素E粉的鈰量法檢測條件，通過與氣相方法的檢測結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)所建立鈰量法方法簡便，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好。鈰量法屬于總含量測定方法，不能測定天然維生素E中的單體含量，且由于天然維生素E提取物中含有一些還原性物質(zhì)，會在鈰量法中參加反應(yīng)，導致VE含量測定結(jié)果高于其在產(chǎn)品中的實際含量，因此鈰量法測定天然維生素E含量時，無法保證其特異性及準確性。

3 展望

在近年開發(fā)的眾多檢測方法中，正相色譜法對天然維生素E各異構(gòu)體具有較高的分離效率，更易實現(xiàn)8種異構(gòu)體的基線分離檢測；超高效合相色譜技術(shù)因使用超臨界CO2作為流動相，且具有較大的載樣能力，較適用于維生素E單體樣品的分離制備；而快速檢測技術(shù)是未來檢測技術(shù)的發(fā)展方向，近紅外光譜或拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學計量學工具用以對天然產(chǎn)物中的活性成分進行快速分析將會成為未來研究關(guān)注的重點。因此，建立適合的天然維生素E檢測方法，分析樣品中不同生育酚和生育三烯酚的含量及分布，有利于指導人們更加有效、合理的使用天然維生素E，使天然維生素E產(chǎn)生更高的應(yīng)用價值

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Natural vitamin E（VE）is a kind of antioxidant which exists in plant oils.VE was found to possess unique features，such as safety，high efficiency，non-toxic.Therefore，it has been widespread concerned and used in foods，feeds，medicines，and cosmetics.In order to control the quality of nature VE，several analysis methods have been developed based on its physical and chemical properties.This article reviewed the natural VE detection technologies，such as chromatography，spectrum，and electrochemical detection techniques.At the same time，the basic principle and relative merits of the analysis methods have also been discussed.The sensitivity，accuracy and detection limit of each method were compared，in order to selectthe mostsnitable method to determine the samples.

naturalvitamin E；tocopherol；tocotrienol；detection techniques

S816.17

A

1004-3314（2017）15-0028-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171507

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目課題（2016YFF0201802）

*通訊作者