柞蠶免疫蛹粉在凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

孫永欣，馬淑慧，米銳，孟楠，溫志新，李學(xué)軍，李亞潔，都興范，李樹英

水產(chǎn)養(yǎng)殖

柞蠶免疫蛹粉在凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

孫永欣，馬淑慧，米銳，孟楠，溫志新，李學(xué)軍，李亞潔，都興范，李樹英*

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連116024）

本文采用體外誘導(dǎo)法制備含有抗菌活性物質(zhì)的柞蠶蛹粉（IPP），將其以不同比例（0、0.5%、1.0%）添加到凡納濱對蝦（體重約8.3 g/尾）基礎(chǔ)飼料中，喂養(yǎng)5周后測定其增重率、肌肉組成成分、成活率和免疫力，喂養(yǎng)試驗結(jié)束后進行10 d的水浴攻毒（哈維氏弧菌108/mL），研究飼喂IPP對凡納濱對蝦免疫保護率的影響。結(jié)果表明：飼喂IPP組對蝦體增重率均高于對照組，其中1.0%劑量組比對照組提高35.15%，達到顯著水平（P＜0.05）；0.5%和1.0%組成活率分別比對照組提高7.73%和10.60%（P＜0.05）；肌肉成分檢測表明，1.0%試驗組粗脂肪含量顯著高于對照組（P＜0.05）；飼喂IPP組對蝦血清超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）和多酚氧化酶（PPO）都顯著高于對照組（P＜0.05），最多分別比對照組提高11.65%、50.07%、66.55%和7.30%。飼喂IPP組致病菌的免疫保護率也顯著高于對照組（P＜0.05）。綜上，柞蠶免疫蛹粉可顯著提高凡納濱對蝦增重率和抗病力，并且其適宜添加量為1.0%。

凡納濱對蝦；蛹粉；生長；免疫

凡納濱對蝦又稱南美白對蝦，是目前我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對蝦品種。近年來其養(yǎng)殖產(chǎn)量和占比不斷遞增，2013年凡納濱對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量為142.99萬t，占全國蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的51.4%（中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2014），2014年達到157.7萬t，占全國蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的90.24%（中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2015）。然而，病毒和弧菌疾病給對蝦養(yǎng)殖帶來的危害越來越嚴重（Ballamoole等，2014；Escobedo，2011；Austin，2010）?？股乇粡V泛用于對蝦等水產(chǎn)動物的疾病防治，但易產(chǎn)生病原菌的耐藥性以及藥物殘留問題，嚴重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展（Boyd和Massaut，1999；許兵等，1993）。

為了尋求安全有效的養(yǎng)殖方式，科研工作者開發(fā)出多種免疫增強劑，以替代抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，并取得了較好效果（王曉琳等，2016；湯菊芬等，2015；譚崇桂等，2013；宋理平等，2010）。研究表明，體外生物誘導(dǎo)制備的含有抗菌活性物質(zhì)（包括抗菌蛋白、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等）的柞蠶免疫蛹粉（IPP），在海參養(yǎng)殖中表現(xiàn)出顯著的免疫增強效果和抗病力效果（孫永欣等，2016），鑒于對蝦免疫系統(tǒng)和海參相似，本文將IPP用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖中，通過研究其對凡納濱對蝦生長和免疫力的影響拓展柞蠶資源綜合利用，并為開發(fā)新型免疫增強劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料制備柞蠶免疫誘導(dǎo)蛹粉（IPP）由體外生物誘導(dǎo)法制備?；A(chǔ)飼料（對照組）為廣東恒興飼料，試驗原料以魚粉、面粉、豆粕等為主要成分，營養(yǎng)指標如表1所示。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0（對照組）、0.5%、1.0%的IPP，混合均勻后，用噴霧器把飼料打濕攪拌后直接投喂。

表1 基礎(chǔ)飼料營養(yǎng)成分%

1.2 試驗用蝦與飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)試驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院營口水產(chǎn)增殖實驗站進行，試驗用蝦購自廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司。試驗開始時，挑選起始規(guī)格一致對蝦（約8.3 g/尾）分別在8個水泥養(yǎng)殖池（規(guī)格為4m×6m×1.2m，水深0.8 m）中進行，其中4個養(yǎng)殖池作對照組，0.5組和1.0組各用2個養(yǎng)殖池。每個養(yǎng)殖池大約放7000尾共120斤對蝦（養(yǎng)殖密度為6.25斤/m3），試驗周期為5周。期間每日投喂6次（2∶00、6∶00、10∶00、14∶00、18∶00、22∶00），每次投餌量為體重的3%～5%，根據(jù)水溫和水質(zhì)情況適當(dāng)微調(diào)，保證各組基本一致，不間斷充氣，每天上午10∶00前各養(yǎng)殖池換水1/4～1/3，試驗用水采用砂濾天然海水。整個養(yǎng)殖期間，水溫28～32℃，pH 7.8～8.2，鹽度為30‰～32‰，溶氧不低于6.0 mg/L。

1.3 生長指標測定在試驗結(jié)束后測定各養(yǎng)殖池所有試驗蝦終末體重，計算相對增重率和成活率。

相對增重率=（末體重/g—初始體重/g）/（初始體重）×100。

1.4 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分水分采用105℃恒重法（GB/T6435-86）；粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法（GB/T6432-94）；粗脂肪采用氯仿-甲醇抽提法（GB/T6433-94）；粗灰分采用550℃灰化法（GB/ T6438-92）進行測定。

1.5 對蝦免疫指標測定飼養(yǎng)結(jié)束后，從各養(yǎng)殖池中隨機取10～15尾對蝦（每組30尾），用一次性無菌注射器（1 mL）從對蝦圍心腔內(nèi)抽取血淋巴，注入無菌的1.5 mL離心管中，4℃冰箱過夜，次日用無菌針頭劃破血凝塊，析出血清用于免疫指標的測定（Garriques和Arevalo，1995）。

對蝦血清超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒測定，多酚氧化物酶（PPO）使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒測定。

酶活性定義：血清SOD酶活性單位定義為每mL體腔液中SOD抑制率達到50%時對應(yīng)的SOD量為一個酶活性單位（U）；ACP酶活性單位定義為100 mL體腔液在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位；ALP定義為100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位；PPO酶活性單位定義為每分鐘每mL血清在每mL反應(yīng)體系中吸光值變化0.01為一個酶活力單位。

1.6 攻毒試驗參照朱學(xué)芝等（2007）方法，在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每組隨機抽取對蝦45尾（每個池均勻取樣），用含有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的水浸泡凡納濱對蝦，水體中的哈維氏弧菌維持在1×108個/mL，觀察10 d內(nèi)對蝦的死亡情況，計算免疫保護率（宋理平等，2010）。

免疫保護率/%=（1-試驗組死亡率/對照組死亡率）×100。

1.7 數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。采用SPSS17.0進行單因素方差分析，用Dun can’s多重法比較各組間平均值的差異顯著性，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦生長的影響由表2可知，飼養(yǎng)結(jié)束后，對蝦的增重率和成活率以1.0%組最高，兩項指標都顯著高于對照組（P＜0.05），增重率提高了35.15%，成活率提高了10.60%；0.5%添加組增重率也高于對照組，未達到顯著差異水平，但成活率顯著高于對照組（P＜0.05）。

表2 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦生長的影響

2.2 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦肌肉成分的影響由表3可見，各處理組粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量較對照組差異不顯著，但1.0%組粗脂肪含量較對照組顯著提高（P＜0.05）。

表3 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦肌肉成分的影響%

2.3 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦血清免疫指標的影響由表4可見，飼料中添加0.5%和1.0% IPP能顯著提高對蝦血清中SOD、ACP、ALP和PPO酶活性（P＜0.05），其中0.5%組SOD和PPO活性最高，1.0%組ACP和ALP活性最高。

表4 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦血清免疫指標的影響

2.4 柞蠶免疫蛹粉對凡納濱對蝦抗病力影響由表5可知，飼喂IPP對蝦的抗哈維氏弧菌能力得到明顯提高。隨著攻毒試驗進行（0～10 d），各組存活率都在下降，但IPP組對蝦存活率和免疫保護率始終高于對照組，且達到顯著（P＜0.05），對比0.5%和1.0%組發(fā)現(xiàn)，1.0%劑量組免疫保護率比0.5%組更高。

表5 凡納濱對蝦抗病力試驗結(jié)果%

3 討論

柞蠶免疫蛹粉（IPP）被誘導(dǎo)出的抗菌蛋白、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等活性物質(zhì)，統(tǒng)稱為生物抗菌素（呂貴仁等，2011）。已有研究證實，IPP對海珍品生長促進作用明顯（孫永欣等，2016；都興范等，2000），本試驗在對蝦養(yǎng)殖中也得到了同樣結(jié)論。本研究采用的柞蠶免疫蛹粉是在柞蠶蛹基礎(chǔ)上誘導(dǎo)出抗菌活性物質(zhì)，其主要成分是蛹粉。研究表明，柞蠶蛹粉能提高蝦夷馬糞海膽、鯰魚仔魚等水產(chǎn)品增重率并有效降低餌料系數(shù)（Kurbanov等，2015；朱斐等，2009；Habib等，1994），并認為柞蠶蛹粉中的營養(yǎng)物質(zhì)可以改善飼料品質(zhì)，從而提高飼料利用率、促進動物生長。在本試驗中，IPP添加劑量最高只有1%，改善飼料品質(zhì)作用可能不是很明顯。有研究表明，蠶蛹對鯉魚具有強烈的誘食作用，并認為是蠶蛹含有的17種氨基酸的效果，但這種誘食效果并非僅來自于氨基酸，因為隨后的試驗發(fā)現(xiàn)，用這17種氨基酸配制出的混合物誘食作用較蠶蛹提取物作用弱（Tsushima和Ina，1978），這種誘食性對于鯰魚仔魚同樣有效（Akiyama等，1984）。柞蠶蛹中含有的呈味脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)可能對凡納濱對蝦也具有誘食效果，因此，飼料品質(zhì)改善和誘食效果綜合作用提高了對蝦增重率，且對凡納濱對蝦體組分有一定改善作用，體現(xiàn)在體蛋白質(zhì)和脂肪含量增加，且1.0%組體脂肪含量顯著提高，這可能與對蝦個體大小有關(guān)。隨著個體增大，肌肉蛋白質(zhì)和脂肪含量增加，從而提高了對蝦品質(zhì)。

本研究中飼喂IPP的對蝦免疫指標、成活率和免疫保護率均得到明顯提高，這與很多報道結(jié)果類似（李林等，2015；柴仙琦等，2012；宋理平等，2010）。對蝦免疫系統(tǒng)屬先天性免疫，由模式識別受體對病原微生物識別后激發(fā)（Lin等，2008；Sun等，2008）。對蝦體液中含有血細胞、凝集素、抗菌肽、溶菌酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶以及血細胞釋放的酚氧化物酶系統(tǒng)等免疫因子，構(gòu)成蝦類的免疫防御體系（宋理平等，2005），因而這些酶的活性反映了機體免疫的強弱。對蝦體內(nèi)存在多種抗菌肽，這些抗菌肽作為效應(yīng)因子在免疫系統(tǒng)發(fā)揮關(guān)鍵作用（Bachère等，2004）。目前，在對蝦中已發(fā)現(xiàn)的8種抗菌肽大多存在于血淋巴細胞（Zhao和Wang，2008），并推測當(dāng)機體受到刺激時血淋巴細胞中的抗菌肽可釋放到血液中參與免疫防御（Martin等，1998；Toh等，1991）。而抗菌肽攝入時，可使細胞質(zhì)顆粒和體液循環(huán)系統(tǒng)中儲存的抗菌肽含量提高，機體受到外源微生物侵入可激發(fā)血淋巴細胞釋放更多抗菌肽對外來病原菌殺傷。以此推測，對蝦攝食含有抗菌肽的IPP后，會誘發(fā)血淋巴細胞進一步釋放體內(nèi)抗菌肽，從而增強機體對哈維氏弧菌的抗病力；其次，抗菌肽作為模式識別中的效應(yīng)因子，可啟動對蝦體內(nèi)免疫反應(yīng)，表現(xiàn)在SOD、ACP、ALP和PPO免疫指標的提高。此外，研究表明，海參攝食IPP（0.5%～2.0%）后，腸道菌群結(jié)構(gòu)得到優(yōu)化，乳酸菌屬和芽孢桿菌屬均明顯高于對照組，且弧菌屬顯著降低（Ma等，2017），因此我們推測，IPP也可能通過改善對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而提高腸道免疫和健康程度，增強機體免疫力和抗病力，這需要下一步試驗進行驗證。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，飼料中添加0.5%和1.0%柞蠶免疫蛹粉能明顯提高凡納濱對蝦增重率、成活率和抗病力，對實際養(yǎng)殖增收增產(chǎn)效果明顯，并建議在飼料中實際添加量最好不超過1.0%。

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Immunity induced pupae of Antheraea Pernyi powder（IPP）was supplemented into basic diets of Penaeus vannamei（average weight about 8.3 g/individual）with the different levels（0，0.5%and 1.0%）.After 5 weeks feeding experiment.The growth，muscle composition，survival rate and immunity of Penaeus vannamei were determined.At the end of the feeding trail，immunoprotective rate was investigated after the shrimp in challenge with Vibrio harveyi（108CFU/mL）for 10 days.The results showed that the weight gain rate of the IPP group was significantly higher than that in the control group，moreover，the 0.1%group increased by 35.15%（P＜0.05）.In addition，the survival rate of 0.5%and 1.0%IPP groups increased by 7.73%and 10.60%respectively compared with the control group（P＜0.05）.Muscle composition test showed that the shrimp fed with 1.0%IPP exhibited significant increase of lipid contents compared with the control group（P＜0.05）.Dietary supplementation of IPP significantly increased the activities of serum superoxide dismutase（SOD），acid phosphatase（ACP），alkaline phosphatase（ALP），polyphenol oxidase（PPO），the maximum value were increased by 11.65%，50.07%，66.55%，7.30%respectively.The immunoprotective rate against the infectious bacteria was also significant higher than that in the control group（P＜0.05）.In conclusion，IPP in diet could significantly increased the weight gain and the pathogen resistance of Penaeus vannamei，and its suitable addition was 1%.

Penaeus vannamei；powder；growth；immunity

S963

A

1004-3314（2017）15-0020-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171505

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-22）；遼寧省重大科技攻關(guān)項目（2014209001）

*通訊作者