動態(tài)濁度法測定注射用鹽酸大觀霉素中細菌內(nèi)毒素的含量

陳莉，張嘯，劉永革，馮鳳嬌

（1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟寧272021；3.中國藥科大學，江蘇 南京 211198）

動態(tài)濁度法測定注射用鹽酸大觀霉素中細菌內(nèi)毒素的含量

陳莉1，張嘯2，劉永革2，馮鳳嬌3

（1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟寧272021；3.中國藥科大學，江蘇 南京 211198）

目的：為建立注射用鹽酸大觀霉素細菌內(nèi)毒素定量方法提供參考。方法：建立動態(tài)濁度法測定細菌內(nèi)毒素標準曲線，驗證可靠性，考察樣品對細菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況，確定樣品的最大無干擾濃度，驗證方法的精密性和準確性，并進行初步應用。結(jié)果：標準曲線可靠性驗證中，相關(guān)系數(shù)r＞0.99，標準曲線可靠。供試品用苯甲醇注射液溶解后稀釋并添加內(nèi)毒素標準品，制成供試品終濃度3.92 mg/mL及內(nèi)毒素終濃度為0.25 Eu/mL的溶液，測得其回收率接近100%，供試品該濃度對內(nèi)毒素測定的干擾較小。方法的精密度驗證中，標準曲線各濃度點3次測量結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%，供試品加入標準曲線各濃度點的內(nèi)毒素標準品后測定3次，結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%。準確率驗證中，供試品中加入內(nèi)毒素標準品終濃度為1.25，0.25，0.05 Eu/mL時回收率在91%～107%，加入內(nèi)毒素終濃度為0.01 Eu/mL時回收率為73%和86%。另外，日常檢測3批供試品的內(nèi)毒素含量均小于限值，回收率在101%～103%。結(jié)論：動態(tài)濁度法可用于定量檢測注射用鹽酸大觀霉素的細菌內(nèi)毒素。

動態(tài)濁度法；注射用鹽酸大觀霉素；內(nèi)毒素；定量

細菌內(nèi)毒素是藥品中最普遍和主要的致熱原，可引起機體發(fā)熱甚至休克[1]。為了保證注射用藥品的安全性，各國藥典均將內(nèi)毒素檢測列入檢查項目，內(nèi)毒素含量的控制也成為藥品質(zhì)控的重要對象之一[2]。

大觀霉素是一種主要用于淋病奈瑟菌所致的尿道炎、前列腺炎、宮頸炎和直腸感染[3]的氨基苷類抗菌藥，臨床常用其鹽酸鹽?！吨腥A人民共和國藥典》（2015年版）收載有鹽酸大觀霉素及注射用鹽酸大觀霉素，其中對于致熱物質(zhì)的檢查采用細菌內(nèi)毒素檢查法。

目前所使用的內(nèi)毒素檢查法多為凝膠法，但其是一種半定量測定方法，無法給出準確的含量，而為了更好滿足藥品檢查和生產(chǎn)過程質(zhì)控的嚴格要求，內(nèi)毒素檢測已逐漸向定量方向發(fā)展。動態(tài)濁度法是內(nèi)毒素定量方法的一種，具有批量大，靈敏度高，檢測范圍寬等優(yōu)點[4]，能較為真實客觀地反映藥品的質(zhì)量。相較與動態(tài)顯色法，動態(tài)濁度法不易受樣品干擾的影響，更適用于對鱟試劑有干擾的樣品[5]。

本文參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）細菌內(nèi)毒素檢查法進行試驗，采用動態(tài)濁度法檢測注射用鹽酸的細菌內(nèi)毒素含量，并對方法進行驗證及初步應用，為該品種建立合適的內(nèi)毒素定量方法打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 供試品

注射用鹽酸大觀霉素：包含注射用鹽酸大觀霉素1瓶（2 g/瓶，批號：160304，160305，160306，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）和苯甲醇注射液1瓶（3.2 mL/瓶，批號：1512162311，辰欣藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 實驗材料

Biotek Elx808酶標儀（美國Biotek公司）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（湛江安度斯生物有限公司，批號：150601-201581規(guī)格：80 EU/支）；動態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號：1607150，規(guī)格：1.25 mL/支，靈敏度0.01 Eu/mL）；動態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號110604，規(guī)格：0.1 mL/支，靈敏度0.5 Eu/mL）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號：1701170，規(guī)格：5 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌內(nèi)毒素限值的確定

《中華人民共和國藥典》（2015年版）規(guī)定，注射用鹽酸大觀霉素內(nèi)毒素的限值為每0.075 Eu/mg，試驗中注射用鹽酸大觀霉素規(guī)格為2 g/瓶，則限值可表示為150 Eu/mg。

2.2 標準曲線的可靠性驗證

取細菌內(nèi)毒素工作標準品1支（80 Eu）加入0.8 mL BET水復溶，濃度為100 Eu/mL的儲備液，將10 Eu/mL標準品用BET水稀釋為1.25，0.25，0.05，0.01 Eu/mL的標準內(nèi)毒素系列溶液。取無熱原微孔板，每孔加入100 μL的BET水作為陰性對照和各濃度標準液，標準品為平行3個復孔，再加入100 μL的動態(tài)濁度鱟試劑并混勻，放入酶標儀中于37℃孵育70 min，每隔30 s檢測樣品在405 nm的吸光度。

以反應時間的對數(shù)LogT為縱坐標，內(nèi)毒素濃度的對數(shù)LogC為橫坐標，繪制標準曲線線性回歸方程，

標準曲線的線性較好，且陰性對照的反應時間大于標準曲線最低內(nèi)毒素濃度0.01 Eu/mL的反應時間，各平行孔的CV均＜10%，標準曲線成立。

2.3 最大稀釋倍數(shù)（MVD）計算

注射用鹽酸大觀霉素樣品1瓶（2 g），用苯甲醇注射液3.2 mL復容后，經(jīng)測定總體積為5.1 mL，即濃度為392 mg/mL，限值為0.075 Eu/mg，根據(jù)

c為供試品濃度，L為限值，λ為標準曲線的最低濃度0.01 Eu/mL，則MVD＝2 940（0.13 mg/mL）。

2.4 供試品干擾實驗

根據(jù)MVD的結(jié)果，取批號為160304的供試品，用苯甲醇注射液復容后，用BET水依次稀釋5倍（78.4 mg/mL），25倍（15.68 mg/mL），50倍（7.84 mg/mL），250倍（1.57 mg/mL）4個梯度，作為供試品溶液，以制備最終稀釋分別為10倍（39.2 mg/mL），50倍（7.84 mg/mL），100倍（3.92 mg/mL）的供試品回收溶液，選擇0.25 Eu/mL作為靠近曲線中點的內(nèi)毒素濃度λm，將2倍于對應稀釋濃度的供試品稀釋液與0.5Eu/mL的內(nèi)毒素標準液1:1稀釋，制備內(nèi)毒素終濃度為0.25 Eu/mL的供試品回收溶液，陰性對照和供試品回收溶液均做2個平行復孔，置酶標儀中孵育并檢測，根據(jù)標準曲線計算細菌內(nèi)毒素的含量和回收率。

表1結(jié)果顯示，在動態(tài)濁度法中，供試品濃度為3.92 mg/mL（稀釋100倍）時，其回收率平均值為100%，在50%～200%范圍內(nèi)，且接近100%，對檢測結(jié)果干擾較小，因此采用100倍稀釋液進行檢驗。

表1 動態(tài)濁度法供試品干擾試驗結(jié)果

2.5 準確性驗證

在供試品中加入內(nèi)毒素標準品，使其終濃度分別為1.25，0.25，0.05，0.01 Eu/mL的標準內(nèi)毒素，測定2個復孔，計算回收率。

檢測結(jié)果顯示，含有內(nèi)毒素終濃度為1.25，0.25，0.05 Eu/mL的注射用鹽酸大觀霉素供試品的回收率在91%～107%，而內(nèi)毒素終濃度為0.01 Eu/mL時，回收率較低，為73%和86%，但仍在50%～100%范圍內(nèi)，見表2，表明該方法準確性較好。

表2 動態(tài)濁度法檢測供試品內(nèi)毒素含量的準確性

2.6 精密性驗證

用建立的方法檢測標準內(nèi)毒素的各個濃度（1.25，0.25，0.05，0.01 Eu/mL），每個濃度重復檢測3次，計算變異系數(shù)；在供試品中加入內(nèi)毒素標準品，使其終濃度分別為1.25，0.25，0.50，0.01 Eu/mL的標準內(nèi)毒素，測定2個復孔，測定3次，計算結(jié)果及3次結(jié)果間的變異系數(shù)（CV）。

檢測結(jié)果顯示，4個濃度的標準內(nèi)毒素檢測結(jié)果的CV值均＜10%，見表3；加入各濃度內(nèi)毒素標準品的注射用鹽酸大觀霉素供試品檢測結(jié)果的CV值均＜10%，見表4。表明該方法精密性較好。

表3 動態(tài)濁度法檢測內(nèi)毒素標準品的精密性

表4 動態(tài)濁度法檢測供試品內(nèi)毒素含量的精密性

2.7 方法的初步應用

細菌內(nèi)毒素標準品按“2.2”項方法制備細菌內(nèi)毒素標準系列溶液；三批次注射用鹽酸大觀霉素樣品按“2.4”項方法制備供試品溶液，并制備含標準內(nèi)毒素的供試品溶液（添加的標準內(nèi)毒素終濃度為0.25 Eu/mL），每個濃度設(shè)2個平行孔；另取2孔加入0.1 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照；再向上述各孔中分別加入0.1 mL動態(tài)濁度鱟試劑，混勻后放入酶標儀進行檢測，經(jīng)酶標儀的Gen軟件處理數(shù)據(jù)，并自動計算出供試品的內(nèi)毒素含量檢測結(jié)果以及對應的回收率。

結(jié)果顯示，對三批注射用鹽酸大觀霉素進行內(nèi)毒素檢測，均未檢出內(nèi)毒素，見表5，結(jié)果符合規(guī)定。

表5 動態(tài)濁度法檢測三批次注射用鹽酸大觀霉素細菌內(nèi)毒素含量的結(jié)果

3 討論

鹽酸大觀霉素是臨床治療淋病的常用藥物，其內(nèi)毒素含量的準確測定不僅是限值的測定，對其質(zhì)量控制具有重要意義。因此，本實驗采用動態(tài)濁度法建立注射用鹽酸大觀霉素的內(nèi)毒素定量方法，以期更好的滿足質(zhì)控的要求。

根據(jù)文獻報導[6]，在凝膠法中，該品種制劑注射用鹽酸大觀霉素對細菌內(nèi)毒素檢查試驗具有一定的干擾，對此，本實驗參照國內(nèi)外文獻資料[7-8]，采用動態(tài)濁度法，首先考察樣品對細菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況。干擾實驗結(jié)果表明，樣品稀釋至3.92 mg/mL，其回收率在100%左右樣品，對檢測結(jié)果的干擾作用較小，該濃度與文獻報道中凝膠法測得的無干擾濃度3.333 mg/mL相一致[6]，所以后續(xù)檢測均采用此濃度作為供試品終濃度進行測定。隨后對該方法的精密度進行了驗證，結(jié)果表明內(nèi)毒素標準品濃度在0.01～1.25 Eu/mL范圍內(nèi)，標準曲線線性關(guān)系良好，r＞0.99。樣品中加入各濃度的內(nèi)毒素標準品，檢測結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%，回收率在50%～200%，表明該方法具有較好的精密性。在方法的準確性驗證中，當供試品中添加的內(nèi)毒素標準品終濃度在1.25，0.25，0.05 Eu/mL時，回收率在91%～107%，準確性較好，但在內(nèi)毒素終濃度在0.01 Eu/mL時回收率為73%和86%，回收率偏低，但仍在50%～100%范圍內(nèi)，說明該方法準確性總體較好。本文依舊采用0.01 Eu/mL作為標準曲線的最低濃度，是考慮到供試品中內(nèi)毒素含量極低，幾乎檢測不到，所以需要更低的靈敏度來測定，測得的結(jié)果可作為樣品質(zhì)控的參考。而內(nèi)毒素終濃度在0.01 Eu/mL時回收率偏低的原因，我們推測可能的原因為該內(nèi)毒素濃度已為動態(tài)濁度法鱟試劑的靈敏度下限，導致測量準確度偏低。在方法的初步應用中，將三批樣品稀釋至終濃度為3.92 mg/mL時進行檢測，檢查結(jié)果均小于限值，結(jié)果均符合規(guī)定。

在動態(tài)濁度法中，樣品的無干擾濃度與凝膠法一致，但是動態(tài)濁度法具有更高靈敏度，能夠更為真實客觀的反應樣品中的內(nèi)毒素含量，更適用于樣品生產(chǎn)過程中的質(zhì)控和對樣品質(zhì)量的監(jiān)控。

因此，用動態(tài)濁度法檢測注射用鹽酸大觀霉素制劑的細菌內(nèi)毒素含量的方法是可行的，且具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，能很好地滿足質(zhì)控的要求，可為完善該品種的質(zhì)量標準提供參考。

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本文編輯：魯守琴

Determination of Bacterial Endotoxin Content in Spectinomycin Hydrochloride for Injection by Kinetic Turbidimetric Assay

Chen Li1, Zhang Xiao2, LiuYong-ge2, Feng Feng-jiao3
(1. Suzhou Institute for Drug Control, Jiangsu Suzhou 215104, China; 2. Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., Shangdong Jining, China; 3. China Pharmaceutical University, Jiangsu Nanjing 211198, China)

Objective：To provide a reference for developing a method for determination of bacterial endotoxin content in spectinomycin hydrochloride for injection. Methods：The standard curve for determination of bacterial endotoxin by kinetic turbidimetric assay was plotted and verfieid for reliability. The interference of samples to determination of bacterial endotoxin was investigated to determine the maximum sample concentration without interference. The method was verifed for precision and accuracy, and preliminarily applied. Results：In the reliability experiment of standard curve, all the r values of the curve were more than 0.99, indicating the validity of the standard curve. However, in the interference experiment, the samples were dissolved and diluted with benzil alcohol injection, added with standard endotoxin to prepare a solution at a fnal sample concentration of 3.92 mg/mL and a fnal endotoxin concentration of 0.25 Eu/mL. The recovery rate of endotoxin was nearly 100%, and the samples at the said concentration showed little interference to the determination of endotoxin. The coeffcients of variation of determination results of standard endotoxin at various concentrations in three tests as well as the test samples added with standard endotoxin at varoius concentrations in three tests were less than 10%. In verifcation for accuracy, the recovery rates of test samples added with standard endotoxin to fnal concentrations of 1.25, 0.25 and 0.05 Eu/mL were 91%～107%, while those at fnal endotoxin concentration of 0.01 Eu/mL were 73% and 86%. In addition, allthe endotoxin contents in three batches of samples were less than the limited value by routine test, with recovery rates of 101%～103%. Conclusion：Kinetic turbidimetric assay is applicable to the quantitative determination of bacterial endotoxin in spectinomycin hydrochloride for injection.

Kinetic Turbidimetric Assay; Spectinomycin Hydrochloride for Injection; Endotoxin; Quantitative Determination

R927.11

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.014

2017 - 04 - 26

陳莉，女，博士，副主任藥師。研究方向：藥品檢驗。通訊作者E-mail:chenli7710@126.com