無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫分子研究概述

劉文杰

(福建省廈門市大同中學(xué) 361009)

章躍陵

(廣東汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系/廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 515063)

無(wú)脊椎動(dòng)物的先天防御體系是在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中進(jìn)化形成的，非常有效且功能強(qiáng)大，其生物學(xué)意義已被廣泛認(rèn)識(shí)。無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)有很高的同源性，其相關(guān)研究成果可以為理解更復(fù)雜的高等動(dòng)物免疫反應(yīng)提供線索。此外，隨著耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和傳統(tǒng)抗生素治療作用的下降，亟需尋找新型抗致病菌的活性物質(zhì)。因此，關(guān)于無(wú)脊椎動(dòng)物的先天免疫分子的研究是一個(gè)熱點(diǎn)。

1 無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫分子

一般認(rèn)為，無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏真正的抗體和特異性的免疫細(xì)胞，機(jī)體防御反應(yīng)依靠非特異性的先天免疫，與之相關(guān)的先天免疫分子是免疫反應(yīng)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。

1.1 酚氧化酶 酚氧化酶(PO)是生物體內(nèi)一類含銅氧化酶，能通過(guò)氧化酚或多酚形成對(duì)應(yīng)的醌，大體可分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶三大類(后二者統(tǒng)稱為多酚氧化酶)。無(wú)脊椎動(dòng)物的多酚氧化酶常以酶原的形式存在，其活性位點(diǎn)由一個(gè)保守的苯丙氨酸占據(jù)并阻擋底物進(jìn)入，不具有酶活性，需要時(shí)經(jīng)過(guò)特異絲氨酸蛋白酶的切割形成有活性的PO才能起作用。

昆蟲(chóng)多酚氧化酶是一種非常重要的免疫蛋白，可同時(shí)介導(dǎo)體液和細(xì)胞有關(guān)成分參與免疫，是誘發(fā)黑化反應(yīng)的主要酶，對(duì)于防止病原微生物入侵以及傷口愈合至關(guān)重要。依靠多酚氧化酶的免疫作用，昆蟲(chóng)可以在發(fā)病前清除大部分病原物，若多酚氧化酶的活性消失或被有效抑制后，昆蟲(chóng)對(duì)病原物的抵抗力顯著下降[1]。漆酶型PO是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物免疫應(yīng)答系統(tǒng)的重要組成部分，其氧化產(chǎn)物通常具有窄譜抗菌活性，且對(duì)弧菌有強(qiáng)烈的殺傷抑制作用，但與昆蟲(chóng)漆酶型PO在氧化產(chǎn)物抗菌譜上的差異顯著。此外，漆酶型PO自身可通過(guò)多種方式有效應(yīng)答病毒、細(xì)菌和真菌的入侵，對(duì)病原的刺激非常敏感、應(yīng)答迅速，在無(wú)脊椎動(dòng)物免疫力調(diào)控和病害預(yù)警中顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值[2]。

1.2 凝集素 凝集素(lectin)是無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的重要組分，存在于細(xì)胞外基質(zhì)以及血淋巴細(xì)胞表面、細(xì)胞基質(zhì)等處。凝集素也廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中。凝集素是一類對(duì)特定細(xì)胞多糖具有結(jié)合親和力的、多價(jià)構(gòu)型的熱敏蛋白或糖蛋白復(fù)合物，能選擇性凝集脊椎動(dòng)物血細(xì)胞、微生物細(xì)胞和單細(xì)胞藻類以及沉淀某些復(fù)雜碳水化合物。因此，可凝集外來(lái)病原菌、進(jìn)行非己識(shí)別、調(diào)理和介導(dǎo)血細(xì)胞吞噬，在免疫應(yīng)答早期階段發(fā)揮著積極的作用。

軟體動(dòng)物中的凝集素在識(shí)別異體、凝集和吞噬等方面發(fā)揮著重要作用，如櫛孔扇貝(Chlamysfarreri) 的血淋巴細(xì)胞內(nèi)有多種含量豐富的凝集素，可凝集大腸桿菌等，并在細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用中起協(xié)同作用[3]。文蛤(Meretrixmeretrix)在受到細(xì)菌刺激后，C-型凝集素基因表達(dá)量顯著上升, 并參與對(duì)微生物入侵的免疫應(yīng)答, 有助于提高文蛤等的免疫防御能力[4]。對(duì)幾種棘皮動(dòng)物凝集素的研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谶M(jìn)行調(diào)理作用和創(chuàng)傷修復(fù)等防御機(jī)制中起重要作用。例如，擬球海膽(Paracentrotuslividus) 紅細(xì)胞凝集素可能參與凝血作用、創(chuàng)面修復(fù)作用、調(diào)理作用和包囊作用，刺瓜參(Cucumariaechinata) 中C型凝集素可溶解兔和人的紅細(xì)胞，并可能對(duì)外來(lái)微生物產(chǎn)生毒性等[5]。

1.3 抗菌肽 抗菌肽(AMPs)是無(wú)脊椎動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的主要成分之一，是高效、具有廣譜抗微生物(細(xì)菌和真菌)的活性小分子多肽，一般由12～100個(gè)氨基酸殘基組成，具有親脂、親水性(雙親性)?？咕牡目咕鷻C(jī)制與傳統(tǒng)抗生素截然不同，特點(diǎn)是分子量小、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無(wú)免疫原性、殺菌速度快和不易被蛋白酶水解等，在無(wú)脊椎動(dòng)物防御病原微生物中起著重要作用，被譽(yù)為“天然抗生素”。自Boman等發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗菌肽——天蠶素以來(lái), 人們相繼又從細(xì)菌、真菌、高等植物、昆蟲(chóng)、兩棲類、哺乳動(dòng)物甚至人體中發(fā)現(xiàn)具有類似性質(zhì)的活性多肽。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止到2012年9月已確定的抗菌肽數(shù)量達(dá)到2032種，并且數(shù)據(jù)還在不斷增加中。

現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，抗菌肽除了具有廣譜抗菌活性外，還具有抗病毒和寄生蟲(chóng)等活性，以及趨化和免疫調(diào)節(jié)、中和毒素、抗腫瘤、促進(jìn)血管生成和創(chuàng)傷修復(fù)等生物學(xué)功能[6]。

1.4 血藍(lán)蛋白 血藍(lán)蛋白(hemocyanin)是一種與呼吸作用有關(guān)的含銅蛋白，其特點(diǎn)是脫氧狀態(tài)為無(wú)色，結(jié)合氧時(shí)呈藍(lán)色，存在于節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物的血淋巴中。通常認(rèn)為血藍(lán)蛋白的主要生物學(xué)功能與機(jī)體內(nèi)的氧運(yùn)輸有關(guān)，故與血紅蛋白、蚯蚓血紅蛋白合稱為動(dòng)物界的三大呼吸蛋白。但近年來(lái)的研究表明，血藍(lán)蛋白還是無(wú)脊椎動(dòng)物中的一種具有多種免疫學(xué)活性的非特異性免疫分子，可以識(shí)別和抵抗病毒、細(xì)菌、真菌、異種動(dòng)物紅細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等多種病原體。血藍(lán)蛋白及其亞基不僅在胰蛋白酶、甲殼動(dòng)物血細(xì)胞溶解產(chǎn)物等激活下表現(xiàn)出酚氧化酶免疫功能, 而且其自身或裂解產(chǎn)生的不同分子質(zhì)量大小的片段也可以抵御病毒的入侵，具備抗菌活性[7]。例如，對(duì)蝦血藍(lán)蛋白對(duì)魚(yú)、雞、鼠和人的紅細(xì)胞以及對(duì)副溶血性弧菌、大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)明顯的凝集活性[8]。此外，血藍(lán)蛋白還與能量的貯存、滲透壓的維持以及蛻皮過(guò)程的調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。

1.5 補(bǔ)體系統(tǒng) 補(bǔ)體系統(tǒng)是由一系列40多種蛋白質(zhì)分子所組成、有著精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)。補(bǔ)體作為眾多免疫效應(yīng)機(jī)制中的一員，在免疫過(guò)程的末端和吞噬作用以及炎癥反應(yīng)等一起發(fā)揮著作用，是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的樞紐[10]。

Tagawa 等研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)鱟中TtCRP-1、TL-5A、TL-1 和TPL-1分子可以召集C3和B因子的復(fù)合物到革蘭氏陽(yáng)性菌和酵母表面形成C3轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)而催化更多的C3分子結(jié)合到這些微生物表面，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一個(gè)未知的C因子參與其中，提示其可能存在不同于脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體激活途徑[11]。彭茂瀟等[12]對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)中已報(bào)道的C1q、MBL、ficolin等的成分、功能、激活途徑和系統(tǒng)進(jìn)化情況進(jìn)行了較詳盡的比較，現(xiàn)有的結(jié)果表明無(wú)脊椎動(dòng)物可能存在與脊椎動(dòng)物差異較大的補(bǔ)體系統(tǒng)，這預(yù)示著海洋無(wú)脊椎動(dòng)物具有更多特有的補(bǔ)體激活途徑。

1.6 纖維蛋白原相關(guān)蛋白 纖維蛋白原相關(guān)蛋白(FREPs)是含有纖維蛋白原相關(guān)結(jié)構(gòu)域的凝集素家族，其典型分子結(jié)構(gòu)是在N-末端含有1個(gè)或2個(gè)免疫球蛋白超家族(IgSF)結(jié)構(gòu)域，接著是1個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)，在C-末端含有纖維蛋白原(FBG)結(jié)構(gòu)域,具有“非己”識(shí)別能力,并能激活免疫應(yīng)答[13]。研究表明:按蚊中的FREPs-FBN9既能與革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌相互作用，還能強(qiáng)烈凝聚位于蚊子腸上皮細(xì)胞中的嚙齒動(dòng)物或人的瘧原蟲(chóng)，該結(jié)果提示FREPs具有防御活性并能與病原體直接作用。FBN9也可以形成二聚體，并能以不同的親和力結(jié)合到細(xì)菌的表面。研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)體外表達(dá)扇貝、文昌魚(yú)等的FREPs能凝集人的A、B、O型血的紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞，這種有鈣依賴性的凝集可被乙?；衔锾禺愋宰钄?，并且這些重組蛋白在有鈣離子的條件下還能讓革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性大腸埃希菌等細(xì)菌凝集[14]。因此，F(xiàn)REPs被認(rèn)為是參與免疫防御最重要的分子之一，在無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫中起著重要作用[15]。

2 無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體

無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)作為外源物入侵后宿主防御的最重要防線，首先必須能夠識(shí)別“異己”分子，進(jìn)而快速激活體內(nèi)相應(yīng)的信號(hào)通路，產(chǎn)生各種效應(yīng)分子來(lái)殺滅、清除外源物。無(wú)脊椎動(dòng)物能夠識(shí)別在微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，如細(xì)菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(PG)、細(xì)菌DNA及這些生物大分子的衍生物等，識(shí)別這些分子模式的受體統(tǒng)稱為模式識(shí)別受體(PRRs)。這些PRRs的共同特征是配體的不專一性：一種模式識(shí)別受體可以引起不同的免疫防御反應(yīng)，它們的性質(zhì)和功能不盡相同(表1)[16]。

表1 模式識(shí)別受體的性質(zhì)與功能

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PAMPs被識(shí)別后，這些受體引發(fā)激活絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將受到感染的信號(hào)放大或解除錯(cuò)誤信號(hào)(即信號(hào)的調(diào)整和放大過(guò)程),然后引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄，最終激活效應(yīng)物反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生抗菌肽、酚氧化酶等效應(yīng)物[17]。PRRs還可以作為促進(jìn)吞噬的調(diào)理素，也可以是凝集、黑化或其他蛋白質(zhì)修飾級(jí)聯(lián)反應(yīng)等免疫過(guò)程的起始因子。