染色體和細胞核染色常用的三種堿性染料

申定健

(四川省綿竹市南軒中學 618200)

染色體易被堿性染料染色而得其名，堿性染料也能使細胞核染色。在高中生物學教材中，堿性染料在“觀察根尖分生組織細胞的有絲分裂”和“低溫誘導植物染色體數(shù)目的變化”實驗中用于染色體染色，以便觀察染色體形態(tài)、數(shù)目，判斷細胞分裂時期；在“月季的花藥培養(yǎng)”實驗中用于細胞核染色，以檢測花粉是否處于單核期。龍膽紫、醋酸洋紅和苯酚品紅是染色體和細胞核染色實驗常用的三種堿性染料，本文從其分子組成、染色機理、染液pH值、染液配法等方面進行概述，對相關(guān)實驗問題進行釋疑。

1 分子組成

龍膽紫分子式C25H30ClN3，為氯化四甲基副玫瑰苯胺、氯化五甲基副玫瑰苯胺和氯化六甲基副玫瑰苯胺的混合物，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

醋酸洋紅以洋紅和醋酸(CH3COOH)為主要成分，洋紅又稱胭脂紅，是從胭脂蟲雌蟲體內(nèi)提取到的胭脂紅酸，分子式C22H20O13，其分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。

苯酚品紅又稱石炭酸品紅，為苯酚(C6H5OH)與堿性品紅的混合物，堿性品紅分子式：C20H20ClN3，其分子結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖1 龍膽紫的分子結(jié)構(gòu)式

圖2 洋紅的分子結(jié)構(gòu)式

圖3 堿性品紅的分子結(jié)構(gòu)式

2 染色機理

根據(jù)染料化學中經(jīng)典發(fā)色團與助色團理論[1]，有機化合物染料分子結(jié)構(gòu)中至少需要有某些不飽和基團存在時才能發(fā)色，這些基團稱之為發(fā)色基團，主要有-N=N-、=C=C=、-N=O、-NO2、=C=O和苯的衍生物等發(fā)色基團，含有發(fā)色團的分子稱為發(fā)色體。另外，染料有機化合物還含有助色基團，能加強發(fā)色團的生色作用，并增加染料與被染物質(zhì)的結(jié)合力，主要有-NH2、-NHR、-NR2、-OH、-OR等助色基團。染料在配制成染液時，染料分子電離或與其他物質(zhì)電離組合可使染料助色基團帶上電荷，使染料分子極性增強，促進其與被染結(jié)構(gòu)物質(zhì)結(jié)合，從而染上顏色。

上述三種染料的分子結(jié)構(gòu)中，龍膽紫分子以三苯甲烷為發(fā)色基團，以[-N(CH3)2]為助色基團；洋紅分子以苯的衍生物和羰基(=C=O)為發(fā)色基團，以羥基(-OH)和(-OR)為助色基團；堿性品紅分子以三苯甲烷為發(fā)色基團，以氨基(-NH2)和(=NH)為助色基團。此外，像洋紅分子中的羧基(-COOH)助色基團，還可以使染料具有水溶性和對某些物質(zhì)具有染色能力。三種染料的助色基團在酸性環(huán)境中均能帶上電荷，從而與染色體和細胞核等結(jié)構(gòu)物質(zhì)進行極性結(jié)合，進而將其染色。因此，三種染料同時滿足自帶顏色和能與被染結(jié)構(gòu)物質(zhì)結(jié)合的兩大條件。

3 染液pH值

染料按照帶電荷性質(zhì)進行化學分類，帶正電荷為堿性染料，反之則為酸性染料。堿性染料的界定與染液pH值無必然聯(lián)系，故堿性染料染液pH值不一定大于7。

結(jié)合三種染料主要成分的分子結(jié)構(gòu)分析，龍膽紫分子的助色基團[-N(CH3)2]在酸性條件下易與H+結(jié)合而帶正電荷；單純的洋紅雖不能直接染色，但在醋酸等強酸作用下，可使助色基團(-OH、-OR)帶正電荷；品紅在鹽酸作用下，可使助色基團(-NH2、=NH)帶正電荷，形成堿性品紅?？梢钥闯?，三種染料分子助色基團均在酸性條件下帶正電荷。用pH計測定三種染料的染液，龍膽紫染液pH為3.0～5.0，醋酸洋紅染液pH為1.9，改良苯酚品紅染液pH為5.8。因此，三種染料染液均是pH<7的堿性染料。

4 染液配法

龍膽紫染液按照染色對象有不同的配制方法：①觀察有絲分裂過程：取1 g龍膽紫放入10 mL蒸餾水，攪拌使其充分溶解后，再加蒸餾水至100 mL，倒入棕色瓶備用；②觀察洋蔥內(nèi)表皮細胞和口腔上皮細胞結(jié)構(gòu)：取0.1 g龍膽紫放入10 mL蒸餾水，攪拌使其完全溶解后，加蒸餾水至500 mL，倒入棕色瓶備用；③細胞核染色：取1 g龍膽紫放入2 %醋酸溶液中，使其溶解，直至溶液不變成深紫色，倒入棕色瓶備用。

醋酸洋紅的配制：取100 mL 45%醋酸，煮沸0.5 min，加入1 g洋紅，攪拌使其溶解，再加熱煮沸2～5 min，冷卻，過濾，將濾液倒入棕色瓶備用。

改良苯酚品紅染液的配制順序：①原液I：取3 g堿性品紅溶于100 mL 70%酒精中，I液可以長期保存；②原液II：取I液10 mL加入90 mL 5%苯酚水溶液中(此液可保存2周)：③原液III：取II液55 mL加入6 mL的冰醋酸和6 mL 38%的甲醛(倒入棕色瓶可長期保存)；④染色液：取III液10～20 mL，加入80～90 mL 45%醋酸和1.5 g山梨醇，混勻后倒入棕色瓶備用(如果沒有山梨醇，也能染色，但效果稍差)。

5 實驗釋疑

“觀察根尖分生組織細胞的有絲分裂”和“低溫誘導植物染色體數(shù)目的變化”實驗制片前，都要經(jīng)過解離、漂洗和染色步驟。如果生物組織材料在鹽酸解離后，直接用上述三種堿性染料分別染色，染色體和細胞核等結(jié)構(gòu)物質(zhì)都不能著色。究其原因，依據(jù)染料與被染物質(zhì)極性結(jié)合機理，鹽酸的存在可使染色體和細胞核等結(jié)構(gòu)物質(zhì)結(jié)合H+帶正電荷，而堿性染料的助色基團同樣帶正電荷，由于同性電荷相斥，堿性染料不能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合，因而不能染色，而非因酸堿中和染不上色。故要將堿性染料成功染色，須將解離后的材料進行漂洗，去除鹽酸的影響。同樣，此理可以解釋“觀察DNA與RNA在細胞中的分布”實驗染色前同樣需要進行緩水流沖洗。